Fertilização In Vitro Convencional
Aspectos
gerais
Em 25 de julho de 1978 teve início a era das técnicas
de reprodução assistida com o nascimento de
Louise Brown através do auxílio da fertilização
"in vitro" (FIV) com subseqüente transferência
intra-uterina de embriões (Steptoe e Edwards, 1978).
O princípio básico que rege a aplicação
das técnicas de reprodução assistida
consiste em facilitar o encontro dos gametas para que ocorra
a fertilização, tanto no organismo materno
como no laboratório. Para isto, usam-se técnicas
de estimulação ovariana, separação
de espermatozóides, aspiração folicular
e transferência de gametas ou embriões para
o útero ou trompa. Em geral, na escolha entre as
diferentes técnicas de reprodução assistida
devem ser consideradas cinco variáveis : 1. idade
da paciente. 2. história de infertilidade. 3. número
de gametas ou embriões a serem transferidos. 4. habilidade
da equipe com a técnica a ser utilizada. 5. condições
laboratoriais do serviço. Atualmente, a tendência
é caminhar para a escolha de técnica mais
simples, de fácil realização e repetição
ao nível ambulatorial, sem anestesia geral, com arranjos
laboratorias menos complexos, com menor tempo de manipulação
externa de gametas ou embriões e, é claro,
com resultados considerados satisfatórios (Franco
Jr. e Marinho, 1994). Habitualmente, as técnicas
de reprodução assistida podem ser divididas
em dois grupos : a- Técnicas não-invasivas
: quando não ocorre a aspiração folicular,
fazem parte deste grupo os diversos tipos de inseminação
artificial que já foram descritas no capítulo
5. b- Técnicas invasivas : em que ocorre a captação
de óvulos através da aspiração
folicular. Em 1983, Tesarik e cols. descreveram duas gestações
com o uso de uma técnica que consistia na colocação
na trompa, no momento da sua reparação cirúrgica,
de espermatozóides capacitados e óvulos. Em
1984, Asch e cols. publicaram idêntico procedimento
porém com o emprego de laparoscopia ou minilaparotomia,
denominando essa técnica de GIFT (transferência
intratubária de gametas). Uma das condições
para a aplicação desta técnica é
a presença de pelo menos uma trompa permeável.
Originalmente, a captação de oócitos
era realizada por via laparoscópica e, no mesmo tempo
cirúrgico, os oócitos captados são
colocados dentro de um catéter já carregado
com espermatozóides capacitados, sendo ambos introduzidos
na trompa saudável. Uma das desvantagens dessa técnica
seria a exigência de laparoscopia ou laparotomia para
a cateterização tubária, maior tempo
de anestesia geral, além de não ser possível
saber se houve ou não fertilização.
Hoje em dia, alguns grupos executam esse método empregando
a ultra-sonografia vaginal para a coleta dos oócitos,
sendo a transferência dos gametas, executada por via
vaginal através de histeroscopia. Em seguida, Devroey
e cols. (1986) descreveram a transferência intratubária
de zigotos (ZIFT). Em 1987, Yovichi e cols. descreveram
a transferência intratubária de embriões
(TET) que basicamente é uma extensão das técnicas
anteriores pela permanência dos embriões por
tempo de aproximadamente 48 horas no laboratório,
antes de serem transferidos por via laparoscópica
para as trompas. Nos primórdios do seu desenvolvimento,
a FIV visava corrigir os problemas de infertilidade das
mulheres com lesões tubárias. Entretanto,
com a simplificação da técnica e a
melhoria dos resultados, tornou-se evidente que seus horizontes
poderiam ser extendidos para outros casos de infertilidade,
tais como, os de sem causa aparente, presença do
fator imunológico, endometriose, aderências
pélvicas e nas situações de comprometimento
do fator masculino. Atualmente, a FIV convencional está
indicada nas seguintes situações : 1. patologia
tubárias : hidrossalpinge bilateral, ausência
de trompas, falha de recanalização tubária
pós-laqueadura. 2. endometriose (Chillik e cols.,
1985). 3. infertilidade sem causa aparente (Salat-Baroux
e cols., 1990). No momento, a indicação da
FIV para a correção do fator masculino está
sendo totalmente substituida pela injeção
intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Da mesma forma, indica-se a ICSI como a melhor forma de
tratamento para o fator imunológico. Por outro lado,
quando da indicação de FIV deve-se analisar
as condições mínimas de aplicabilidade
da técnica. Estas incluem a presença de pelo
menos um ovário sensível aos esquemas de estimulação
ovariana, um útero normal em termos de função,
assim como uma amostra de sêmen que preencha os critérios
mínimos de execução do procedimento.
O processo de FIV convencional
O processo de FIV convencional consiste de quatro etapas
distintas : 1- Estimulação ovariana; 2- Aspiração
folicular; 3- O processo de FIV em laboratório ;
4- Transferência de embriões para a cavidade
uterina.
Protocolos de estimulação ovariana
As primeiras gestações obtidas com a técnica
de FIV ocorreram após a captação ovular
em ciclo natural. Entretanto, o ciclo natural apresenta
desvantagens pela possibilidade de coleta de apenas um óvulo
e a dificuldade na identificação do momento
ovulatório. Soma-se a isso, as evidências de
que um aumento progressivo das taxas de gestação
possua uma relação direta com o número
de gametas obtidos e, conseqüentemente, dos embriões
transferidos (Laufer e cols., 1984). A estimulação
ovariana teve início com o citrato de clomifeno e
as gonadotrofinas. Em 1980, houve relato da primeira gestação
com o emprego destas medicações (Trounson
e cols., 1981). As gonadotrofinas, apesar de terem sido
usadas por Steptoe e Edwards durante o fim da década
de 70, somente em 1981, com o grupo de Norfolk houve a comunicação
de gravidez com o emprego desta medicação
(Jones e cols., 1982). Atualmente, protocolos usando essas
drogas, isoladas ou associadas são procedimentos
comuns nas diferentes unidades que trabalham com reprodução
assistida. Na metade dos anos oitenta, a maioria dos grupos
utilizava os esquemas convencionais com citrato de clomifeno,
nas doses diárias de 50 a 100mg, durante um período
de 5 dias, tendo início na primeira fase do ciclo
menstrual (5º ao 9º dia ; 2º ao 6º dia,
ou em outra seqüência). A principal gonadotrofina
empregada era a gonadotrofina menopausal humana (hMG), composta
de hormônio folículo estimulante (FSH : 75
UI) e hormônio luteinizante (LH : 75 UI), nas doses
entre uma a três ampolas diárias ou a cada
48 horas . Em 1989, Kemeter e Feichtinger descreveram um
protocolo convencional de estimulação ovariana
que diferia dos anteriores que eram fixos (Frydman e cols.,
1986), por usar uma pílula de baixa dosagem no ciclo
prévio ao da FIV, mantendo um intervalo de 5 dias
entre a parada da pílula e o início da estimulação
ovariana com citrato de clomifeno, hMG e corticóide.
Todavia, permitia-se uma variabilidade do dia de administração
da gonadotrofina coriônica humana (hCG) em função
da resposta individual de cada paciente (protocolo semiprogramado).
No fim dos anos oitenta, a maioria dos centros empregavam
análogos do hormônio liberador de gonadotrofinas
(GnRH-a) associado com hMG nos protocolos de estimulação
ovariana (Rutherford e cols., 1988; Meldrum e cols., 1989;
Lejeune e cols., 1990). Os GnRH-a produzem uma elevação
transitória na produção e liberação
de gonadotrofinas, seguindo-se um bloqueio hipofisário
com a manutenção da droga. Dessa forma, o
ovário torna-se mais sensível ao emprego de
hMG. O GnRH-a é utilizado em protocolo curto ou longo.
No curto, inicia-se seu uso no 1º dia do ciclo menstrual,
quando ocorre o efeito de "flare up" (descarga
inicial de gonadotrofinas) que potencializa a administração
exógena de hMG. No longo, o GnRH-a começa
na metade da 2ª fase do ciclo menstrual ou no primeiro
dia do ciclo, mas sempre empregado por um tempo mínimo
de 14 dias. Como principal vantagem, os GnRH-a evitam a
liberação precoce de LH endógeno, fato
que potencialmente acarretaria falhas no processo de fertilização
dos oócitos em cultura. Por outro lado, diversos
trabalhos têm destacado a importância do emprego
de GnRH-a associado com hMG como protocolo de rotina ou
de primeira escolha para a estimulação ovariana
em programas de FIV. A maioria dos estudos advogam uma superioridade
do uso de GnRH-a + hMG sobre os regimes convencionais de
estimulação ovariana. Entretanto, esses estudos
tem sido retrospectivos e não randomizados (Rutherford
e cols., 1988; Meldrum e cols., 1989; Lejeune e cols., 1990).
Estudos prospectivos e randomizados comparando o uso de
GnRH-a + hMG com protocolos convencionais de estimulação
ovariana são escassos e de resultados contraditórios.
Alguns (Neveu e cols., 1987; Ron-El e cols., 1991) relatam
maiores taxas de gestação com o emprego de
GnRH-a e hMG, outros não identificariam essa superioridade
sobre os esquemas convencionais (Ferrier e cols., 1990;
Maroulis e cols., 1991; Kingsland e cols., 1992, Harrison
e cols., 1994). Apesar desta divergência, dois fatos
destacam-se quando se usa análogos de GnRH-a e hMG
: custo maior do tratamento e maior incidência da
síndrome de hiperestimulação ovariana
nas formas moderada e severa (Ron-El e cols., 1991). Em
1995, Daya e cols. demonstraram, num estudo de meta-análise,
que para ciclos de FIV, o FSH está associado com
um significante maior índice de gestação
do que quando se emprega hMG. Atualmente, no Centro de Reprodução
Humana da Maternidade Sinhá Junqueira o acetato de
leuprolide (Lupron, Abbott) associado com FSH-HP (Metrodin-HP,
Serono) são usados como medicações
de primeira escolha na estimulação ovariana
para os programas de FIV convencional e de injeção
intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Inicia-se o bloqueio no 21º dia do ciclo menstrual
anterior ao procedimento. Após 15 dias, desde que
a menstruação tenha ocorrido, usa-se o FSH-HP
(Metrodin-HP) na dose de 225 UI por dia durante 7 dias,
no 8º dia começa o controle do processo de estimulação
ovariana somente pela ultra-sonografia vaginal (Figura 7.1).
Em 1995, no Centro de Reprodução Humana da
Maternidade Sinhá Junqueira um total de 81 pacientes
(idade média 31.5 ± 4.8 anos) cujos maridos
apresentavam o fator masculino alterado foram submetidas
a esse protocolo em nosso serviço. Uma média
de 9.6 ± 6.3 oócitos foram obtidos, sendo
que 7.1 ± 4.4 em metáfase II. Obteve-se uma
taxa de fertilização dos oócitos após
ICSI de 60%. O número médio de embriões
transferidos foi de 3.2 ± 1.8, com uma taxa de implantação
de 16%. O índice de gestação clínica
nessa população foi de 37%, com uma taxa de
aborto de 10%. A expectativa da obtenção de
+ 30% de partos por punção nesse grupo sugere
uma alta eficiência do uso de FSH puro na estimulação
ovariana para ICSI. Por outro lado, nas pacientes com baixo
recursos econômicos usa-se um esquema denominado de
semiprogramado (esquema de Viena) que consta de um bloqueio
com anticoncepcional de baixa dosagem (etinil-estradiol
30 g e gestodene 75 g) desde o primeiro dia do ciclo menstrual
precedente ao da estimulação ovariana e mantido
por um período mínimo de 21 dias e máximo
de 28 dias, sendo que a última pílula será
tomada sempre numa segunda-feira. Obrigatoriamente, a estimulação
ovariana terá início no 5º dia após
o término da pílula (sempre num sábado),
com citrato de clomifene na dosagem de 100 mg por dia durante
5 dias, FSH-HP (Metrodin-HP) na dose de 150 UI em dias alternados
e dexametasona 0.5 mg por dia (Figura 7.2).
Franco Jr. e cols. (1995a) avaliaram o resultado do uso
de ciclos semiprogramados para estimulação
ovariana em 168 pacientes que realizaram um total de 207
punções para FIV convencional. Os fatores
de infertilidade nessa população foram os
seguintes : tuboperitoneal 65% dos casos, masculino puro
ou associado 9.2%, endometriose 11.1%, ovulatório
4.3%, idiopático 11.6, diversos 2.4%. Não
ocorreu captação de oócitos em 5 procedimentos
(2.4%), obtendo-se um número médio de oócitos
por punção de 5.87 ± 3.3. A taxa de
clivagem embrionária foi de 60.2% ± 36.8,
com transferência de pelo menos um embrião
em 82.6% de todas as punções. O número
médio de embriões transferidos foi de 2.52
± 1.6. O nível de gestação clínica
por punção foi de 23.6%. A taxa de gravidez
clínica por transferência foi de 12.6%, a de
parto por punção foi de 19.8%. A taxa de aborto
foi de 16.3%. Não houve caso de hiperestimulação
ovariana severa. Os resultados foram atrativos devido ao
baixo custo das medicações quando comparadas
com os esquemas de GnRH-a e gonadotrofinas. Nos ciclos estimulados
surge um padrão polifolicular, criando-se uma nova
situação hormonal diversa da fisiológica
(monofolicular). A monitorização da resposta
ovariana torna-se obrigatória para o sucesso do procedimento.
Habitualmente, o crescimento folicular diário é
acompanhado apenas por ultra-sonografia, dispensando-se
as dosagens hormonais (Oliveira e cols., 1993). Em algumas
situações, a determinação indireta
dos níveis de estradiol pode ser obtida através
da avaliação do número e tamanho dos
folículos por ultra-sonografia usando-se a análise
de equação de múltipla regressão
(Franco Jr. e cols., 1993a). Geralmente, quando três
ou mais folículos atingem 17 mm ou mais, desencadeia-se
o processo de maturação dos oócitos
pela administração de hCG na dose de 10.000
UI, sendo programada a captação ovular após
34 a 36 horas. Por outro lado, Oliveira e cols. (1993) estudaram
a espessura e o padrão endometrial por ultra-sonografia
no dia da administração de hCG em 100 ciclos
com estimulação ovariana para FIV. Em 86 ciclos
empregou-se uma estimulação ovariana com um
esquema semiprogramado e nos 14 restantes, usou-se um com
GnRH-a (acetato de leuprolide) na forma de bloqueio de longa
duração seguido de hMG. A espessura endometrial
foi significativamente inferior (p = 0.03) nos ciclos semiprogramados
(8.8 ± 2.0 mm) do que a observada no grupo com análogo
de GnRH (10.2 ± 2.0 mm). A distribuição
dos padrões I (multicamada ou "3 linhas")
e II (inteiramente homogêneo, hiperecogênico
em relação ao tecido endometrial) em ambos
os protocolos de estimulação não foram
significativamente diferentes (p=0.91). A espessura endometrial
no dia da administração de hCG no grupo padrão
I ( 1= 8.9 ± 2.1 mm) foi similar (p=0.76) a observada
no padrão II ( 2 = 9.0 ± 1.9 mm) Além
disso, a espessura endometrial nas pacientes que engravidaram
( g= 8.5 ± 2.2 mm) não diferiu (p=0.22) das
não grávidas ( ng = 9.0 ± 1.9 mm).
Não houve diferença entre a incidência
de gravidez nos grupos com padrão endometrial I e
II (p=0.42). Em conclusão, os dados não evidenciaram
um valor preditivo da gravidez pela análise ultra-sonográfica
da espessura e da refringência endometrial no dia
do uso de hCG em ciclos de FIV. A presença de fase
lútea deficiente nos modelos de estimulação
ovariana é um assunto controvertido. No que diz respeito
aos protocolos convencionais com gonadotrofinas ou citrato
de clomifeno (associados ou não) existem dúvidas
sobre a necessidade de suplementação da 2
fase. No caso do emprego de GnRH-a, deve-se manter a fase
lútea como rotina. Por outro lado, os esquemas de
suplementação da fase lútea baseiam-se
na administração de progesterona, hCG ou combinações
dessas substâncias. A progesterona é usada
na forma oral, vaginal ou injetável, sendo preferencialmente
empregada nos casos de risco de síndrome de hiperestimulação
ovariana (Baruffi e cols, 1991). A progesterona oral ou
vaginal é administrada na dose variável de
300 mg a 600 mg por dia (Utrogestan), a injetável
é usada na dose de 50mg por dia, todas iniciam seu
uso no dia da transferência embrionária, e
são mantidas durante 14 dias até a confirmação
da gravidez. Por sua vez, a hCG é aplicado nas doses
de 1000 UI no 4º , 6º , 8º e 10º dias
após a transferência dos embriões.
Técnicas de coleta do gameta feminino
Os oócitos são colhidos pela aspiração
individual de cada folículo, através de agulhas
especiais. A intervenção é realizada
cerca de 26 a 28 horas da detecção do pico
de LH endógeno (ciclo natural) ou de 34 a 36 horas
após a injeção de hCG (ciclos estimulados).
Basicamente, no processo de captação dos oócitos
dois métodos podem ser utilizados : a laparoscopia
e a ultra-sonografia. A laparoscopia foi o método
clássico introduzido pelos pioneiros da técnica
de FIV. Habitualmente, requer anestesia geral e a prévia
produção de pneumoperitônio, sendo para
isso usado CO2 puro ou uma mistura de gases. Os ovários
são apreendidos por pinças especiais, tracionados
e manipulados de modo que cada folículo seja puncionado
e o conteúdo folicular aspirado. Imediatamente, o
fluido folicular coletado é examinado em microscópio
para a identificação dos oócitos e
seu grau de maturidade. Entretanto, a laparoscopia apresenta
inconvenientes como a morbidade cirúrgica e anestésica,
necessitando considerável aparato de suporte para
sua realização. O processo é sempre
complexo nas situações de aderências
pélvicas extensas e obesidade. Em 1981, Lenz e cols.
usaram a ultra-sonografia com guia para a agulha de punção,
aspirando os folículos ovarianos por via percutânea
e transvesical. Nessa ocasião, concluiram que as
pacientes poderiam ser atendidas em regime ambulatorial,
pois na maioria das vezes apenas uma sedação
discreta e anestesia local eram suficientes para o processo
de coleta dos oócitos. Além disso, a ultra-sonografia
foi empregada com sucesso nas situações de
aderências pélvicas severas que de princípio
contra-indicavam o uso da laparoscopia. Naquela ocasião,
os índices de recuperação dos oócitos
giravam em torno de 57% por punção e não
foram observadas complicações graves no ato,
exceto hematúria transitória em 10% das pacientes.
Em 1983, Wikland e cols. demonstraram que não ocorriam
diferenças importantes entre a captação
por laparoscopia (oócitos recuperados 86.4%, fertilizados
52%, transferência de embriões em 74% dos casos)
e a executada por ultra-som (oócitos recuperados
93%, fertilizados 58%, transferência de embriões
em 71% dos casos). Em 1985, Parsons e cols. iniciaram a
coleta de oócitos por via peruretral. Nesse procedimento,
a bexiga é cheia com solução salina
e após a sondagem vesical, uma agulha é introduzida
através da própria sonda dentro da bexiga,
que é transfixada e a agulha penetra nos folículos
ovarianos. O desconforto da repleção vesical
e a hematúria, assim como a dor, após o procedimento,
tornaram essa via pouco utilizada com o advento do transdutor
vaginal (Feichtinger e Kemeter, 1986). Finalmente, a introdução
da via vaginal tornou a ultra-sonografia o método
preferencial (Franco Jr. e Serafini, 1985). A compressão
do fundo de saco vaginal lateral e posterior pelo transdutor
vaginal, permite que a agulha de punção aproxime-se
do ovário, tal fato aumenta a eficiência do
processo de coleta. A punção vaginal causa
poucas complicações, exceto discretas perdas
sanguíneas de origem vaginal no pós-operatório
imediato ou incomuns descrições de infecção
pélvica pós-punção.
O processo de fertilização "in vitro"
em laboratório
Os oócitos colhidos são imediatamente transferidos
para os meios de cultura. Os meios de cultura são
constituidos por íons em concentrações
próximas das encontradas no sangue, substratos energéticos,
albumina e água ultra-purificada (Rinehart e cols.,
1988). O tempo mostrou que as taxas de gravidez são
independentes do meio de cultura utilizado, sejam aqueles
produzidos no laboratório ou preparados para pronto
uso. Nos serviços que preparam seu próprio
meio de cultura, cuidados especiais devem ser tomados na
obtenção de água ultra-purificada para
diluição dos reagentes. Comumente, os meios
de cultura são enriquecidos com fluidos biológicos,
especialmente, o soro humano inativado (da paciente ou de
um "pool" de soros do cordão umbilical).
A experimentação animal e humana mostrou que
os componentes do soro, ainda que inespecíficos são
importantes para o desenvolvimento e aumento das taxas de
clivagem de embriões "in vitro". As concentrações
de soro no meio de inseminação (meio onde
ocorrerá o contacto entre os espermatozóides
e oócitos) variam de 7.5% a 20%. Em seguida, aumenta-se
a concentração de soro para 20% a 40% no meio
de crescimento onde são transferidos os oócitos
já fertilizados (zigotos) e mantidos até as
primeiras clivagens. Não há dados que demonstrem
superioridade entre uma concentração ou outra
de soro, tanto no meio de inseminação, quanto
no de crescimento. O controle de qualidade de todos os componentes
que participam ou entram em contacto com os gametas e embriões,
é um dos aspectos mais importantes num programa de
FIV. Um dos modelos biológicos mais simples para
checar as condições do laboratório
é o teste de sobrevida dos espermatozóides.
Em geral, adiciona-se ou coloca-se em contato por algum
tempo com o meio de cultura, os materiais que precisam ser
testados. Em seguida, capacita-se os espermatozóides
com o meio de cultura, com ou sem o fator problema, verificando-se
qual é o número inicial de espermatozóides
móveis em ambas as situações. Os materiais
são incubados por 24, 48 e 72 horas na temperatura
de 37º C, numa atmosfera com CO2 a 5%. Finalmente,
a curva de sobrevivência dos espermatozóides
(mínimo 50% em 24 horas) em função
do tempo nos tubos de controle e experimental, definem a
presença ou não de um elemento tóxico
na cultura. Além do custo operacional baixo e fácil
aplicabilidade, o teste de sobrevida dos espermatozóides
fornece valiosas informações para a padronização
laboratorial das técnicas de reprodução
assistida. Franco Jr. e cols. (1993b) verificaram que o
teste de sobrevida dos espermatozóides possui uma
eficácia superior a de outros parâmetros do
esperma (morfologia, concentração e motilidade)
na previsão da fertilização dos oócitos
em cultura. A maturação dos oócitos
guarda uma relação direta com o complexo "corona-cumulus"
(Marrs e cols., 1984). Durante o amadurecimento dos oócitos
e a finalização do processo meiótico,
o aglomerado de células de granulosa (cumulus) que
os circunda, sofre um processo de dispersão, fato
que assume uma importância prática como indicador
indireto da evolução morfológica da
maturação (Figura 7.3).
A maior parte dos serviços adota um intervalo de
4 a 8 horas após a coleta dos oócitos para
realizarem a inseminação. Após o preparo
do sêmen, sua concentração é
ajustada para que o material inseminado possua um total
de espermatozóides móveis entre 100.000 a
200.000 para cada oócitos. Cerca de 16 a 18 horas
da inseminação, os oócitos são
passados diversas vezes numa seringa de tuberculina com
uma agulha de 27.5 G, de forma que as células da
granulosa sejam liberadas e observa-se ao microscópio,
a presença de dois pronúcleos (Figura 7.4).
Os pronúcleos são formações
elípticas e simétricas, sendo que a distância
entre os dois varia em função do tempo decorrido
desde a fertilização. Inicialmente, os pronúcleos
estão afastados e progressivamente aproximam-se até
a fusão. Esse exame tem importância na detecção
do fenômeno de polispermia, pela prevenção
da transferência de embriões poliplóides
(Figura 7.5). A verificação dos pronúcleos
ocorre após 18 horas do processo de inseminação
dos oócitos. Os aspectos morfológicos dos
embriões humanos cultivados "in vitro",
poderão, dentro de certos limites no momento da transferência,
prever o aparecimento ou não de gestação.
A imagem referida como "normal" define os blastômeros
como de forma ovóide, de igual tamanho e sem fragmentações
citoplasmáticas. Entretanto, não é
incomum o encontro de blastômeros desiguais, resultando
em clivagens assimétricas, porém com o desenvolvimento
de gravidez e concepto normal. Mauri e cols. (1993) estudaram
num programa de FIV, a relação entre a qualidade
dos embriões transferidos e a taxa de gravidez. Um
total de 119 ciclos de FIV foram analisados, sendo os embriões
obtidos classificados em graus morfológicos segundo
as características dos blastômeros (fragmentação,
regularidade e número). Nas pacientes que engravidaram
(n=34) o grau médio de qualidade dos embriões
transferidos (4.2 ± 1.0) foi superior (p < 0.01)
ao obtido (3.8 ± 1.1) para as que não engravidaram
(n=85). Em conclusão existe uma forte correlação
entre a qualidade dos embriões transferidos e a taxa
de gravidez num programa de FIV.
Transferência de embriões
A transferência embrionária em fase precoce
(zigoto ou pronúcleos) encurtaria a exposição
dos embriões às condições de
cultura "in vitro" e seus possíveis efeitos
deletérios. Por outro lado, a transferência
em estádios mais avançados ficaria mais próxima
dos eventos fisiológicos, pois em curso natural,
o embrião chega ao útero no estádio
de divisão de 8 a 16 blastômeros. Habitualmente,
os serviços de FIV procedem a transferência
de um ou mais embriões em cerca de 48 a 72 horas
do processo de captação dos oócitos.
A maioria das transferências embrionárias uterinas
são realizadas com a paciente em decúbito
dorsal e sem qualquer sedação. Por outro lado,
seria aconselhável identificar com antecedência
o catéter ideal para a transferência. Em geral,
não há diferenças significativas quanto
à eficiência dos diversos catéteres
usados em FIV. Assim sendo, mede-se a cavidade uterina em
ciclos anteriores ao da captação e identifica-se
qualquer dificuldade na passagem do cateter pelo canal cervical.
Em princípio, a manipulação do colo
uterino durante o processo deve ser evitada. Franco Jr.
e cols. (1993c) testaram a hipótese de que a dificuldade
no ato da transferência embrionária poderia
alterar o índice de gravidez num programa de FIV.
Assim sendo, um total de 79 transferências foram analisadas
quanto à complexidade de execução e
divididas em dois grupos : a. quando a transferência
é considerada tecnicamente fácil (passagem
cervical de cateter de Frydman sem resistência) :
52 casos; b. quando a transferência embrionária
foi considerada difícil (necessidade de manipulação
para a passagem de cateter de Frydman ou uso de cânula
metálica) : 27 casos. O índice de gravidez
no grupo A (32,69% por transferência) foi significativamente
maior (p<0.05) do que no grupo B (11.11% por transferência).
Assim sendo, esses dados sustentam a hipótese de
que a dificuldade no ato da transferência embrionária
reduz o índice de gravidez num programa de FIV. Uma
questão importante no ato da transferência
embrionária é a escolha do número ideal.
Sabe-se que as chances de gravidez aumentam numa proporção
direta ao número de embriões transferidos,
mas adotando-se essa norma, eleva-se a probabilidade do
aparecimento de gestações múltiplas
que tradicionalmente estão associadas com uma maior
morbidade fetal e materna (Franco Jr., 1994; Walters, 1996).
A decisão sobre o número de embriões
a serem transferidos deve levar em consideração
diversos fatores, tais como a idade da paciente, a qualidade
dos embriões, quadro clínico, existência
de programa de criopreservação de embriões
e principalmente a opinião do casal infértil.
Azem e cols. (1995) referem que um número de seis
ou mais embriões deveria ser transferido no grupo
de pacientes que não conseguiram engravidar após
4 ou mais ciclos de FIV, afirmando também que na
sua casuística não houve aumento nas gestações
múltiplas. Franco Jr. e cols. (1995b) estudaram a
possibilidade de um escore embrionário cumulativo
(EEC), avaliado pelo número e qualidade dos embriões
transferidos, prever a incidência de gravidez num
programa de FIV. Um total de 293 transferências de
embriões (TE) foram analisadas. No dia da TE (48
horas após a coleta de óvulos) os embriões
foram distribuidos nos seguintes graus : Grau IV. blastômeros
regulares e simétricos; Grau III. blastômeros
irregulares ou menos de 10% de fragmentação;
Grau II. de 10 a 50% de fragmentação dos blastômeros;
Grau I. mais que 50% de fragmentação ou embrião
em estágio de pronúcleo (Figura 7.6 e 7.6
cont.). Em seguida, o grau morfológico do embrião
foi multiplicado pelo número de blastômeros
para produzir um escore qualitativo para cada embrião.
Os escores de todos os embriões transferidos por
paciente foram somados para se obter o EEC para cada paciente.
Um total de quatro grupos de escores cumulativos (EEC I
: 10; EEC II : 11 a 26; EEC III : 27 a 50; EEC IV : >
50) foram estudados quanto a incidência de gestações
clínicas. No EEC I foram realizadas 26 TE e não
se observaram gestações (0%); no EEC II ocorreram
72 TE, com 10 gestações(13.88%); no EEC III
foram feitas 118 TE, com 33 gestações (27.96%)
e no EEC IV, um total de 77 TE, com 32 gestações
(41.5%). As diferenças entre os quatro grupos foram
significativas. O EEC baseado no número e qualidade
dos embriões transferidos possui o poder de prever
a incidência de gestação num programa
de FIV. O diagnóstico da gravidez é realizado
pela medida rotineira de ß-hCG plasmático após
14 dias da transferência dos embriões. Baruffi
e cols. (1995) observaram que a medida quantitativa da ß-hCG
no 14º dia após a transferência embrionária
poderia predizer o curso da gravidez. As amostras de sangue
de 48 pacientes que engravidaram no programa de FIV foram
analisadas por enzimaimunoensaio (Serozyme, Serono). Em
23 casos de gestações únicas que evoluiram
até o nascimento, a média dos valores plasmáticos
de ß-hCG ( =265 153 mUI/ml) foi significativamente
maior (p<0.05, teste Mann-Whitney) do que naquelas observadas
em 12 gestações simples que abortaram ( =149
139 mUI/ml). Por outro lado, 13 gestações
múltiplas que evoluiram até o nascimento,
mostraram uma média dos valores plasmáticos
de ß-hCG ( =435 130mUI/ml) significativamente superior
(p<0.01, teste de Mann-Whitney) `as obtidas na população
com gestação única. Os resultados sugerem
que a determinação dos níveis plasmáticos
de ß-hCG no 14º dia ou 15º dia após
a transferência de embriões pode prever dentro
de certos limites as populações com maior
risco de abortamento e de gestações múltiplas.
Glatstein e cols. (1995) acreditam que valores de hCG 135
mUI/ml e 220 mUI/ml dosados no 14º dia e 15º dia
após a transferência embrionária, teriam
respectivamente 94% e 80% de chance de prever sucesso no
processo de implantação embrionária.
Rotina laboratorial para FIV convencional
A obtenção de resultados consistentes num
programa de FIV depende de vários fatores, entretanto,
a precisão do trabalho laboratorial é fundamental.
Em seguida, descreve-se a rotina do procedimento de FIV
no Centro de Reprodução Humana da Maternidade
Sinhá Junqueira :
Cuidados gerais no laboratório
A limpeza da incubadora deverá ser realizada cada
15 dias, usando-se álcool a 70%, sendo as partes
internas esterilizadas em estufa. A cuba interna deverá
ser preenchida com água ultrapurifica no volume de
6 litros para a manutenção da umidade relativa.
Em seguida, a incubadora deverá ser estabilizada
pelo período de 24 horas. Antes do uso, é
obrigatório a observação da temperatura,
umidade e da pressão de CO2.
Cuidados na véspera do processo de coleta de óvulos
Rever as condições de funcionamento da incubadora
e limpar as bancadas e equipamentos com álcool 70%.
Ligar e verificar o funcionamento dos microscópios
e placas de aquecimento. Colocar o meio de cultura na incubadora
para a obtenção do equilíbrio térmico
e de pH. Conferir o material necessário para o procedimento
de coleta dos gametas (agulha de punção, pipetas,
seringas, placas, guia de punção ultra-sonográfica,
etc).
Cuidados no dia da coleta dos gametas
Coletar o sangue da paciente (jejum) para o preparo do soro
usado para o enriquecimento do meio de cultura. Montar a
sala cirúrgica para a punção folicular
por via ultra-sonográfica. Assepsia vaginal com solução
de Ringer. Usar antibioticoterapia profilática (cefalotina
2g EV) após a captação dos oócitos.
Lavar com meio de cultura a agulha descartável de
punção folicular. Marcar os dados obtidos
durante o processo de coleta dos gametas. Determinar o grau
de maturação dos oócitos segundo a
classificação descrita (Figura 7.8), utilizando-se
como parâmetro de avaliação a relação
corona-cumulus.
Preparo do soro
No dia da punção, retira-se sangue da veia
cefálica do antebraço da paciente, num volume
de 10 a 20 ml, com seringa descartável. Coloca-se
o material em tubos de Corning de 15 ml (estéril).
Centrifuga-se em 1000 g por 10 minutos para que ocorra a
separação da parte sólida da líquida.
Aguarda-se a retração do coágulo na
temperatura de 37º C. O coágulo é comprimido
com seringa de tuberculina acoplada com agulha, centrifugar,
e separar o soro. O soro é transferido por inversão
para um tubo cônico de vidro (borossilicato) lavado
(com água ultrapurificada 20 vezes e, com escova
retira-se os resíduos de soro e repete-se a lavagem
após ferver. A esterilização do tubo
é realizada em estufa na temperatura de 170º
C por 120 minutos). Em seguida, o soro é inativado
pelo calor na temperatura de 56º C por 45 minutos.
Enriquecimento do meio de cultura
O meio de inseminação é preparado com
o meio IVF-50 (Scandinavian-IVF) e soro inativado da paciente
a 10%. Adiciona-se o meio de inseminação em
volume de 0.9 ml para cada lacuna da placa de Nunc, colocando-se
de 1 a 3 oócitos por compartimento. O meio de crescimento
é constituido de IVF-50 com soro inativado da paciente
a 20%, os pronúcleos são transferidos para
esse meio, onde permanecem até o momento da transferência
embrionária.
Preparo do esperma
O esperma é coletado por masturbação
(2 a 5 dias de abstinência sexual) em placa de cultura.
Uma vez liquefeito, devem ser processado segundo as técnicas
descritas no capítulo 4 (Usa-se como meio de cultura
para capacitação dos espermatozóides
o IVF-50, com soro inativado da paciente a 30%). Após
o preparo, determina-se a concentração dos
espermatozóides móveis em progressão
linear. Ajusta-se a concentração entre 1 a
2 x 106 de espermatozóides móveis por ml,
conservando-se o material na temperatura de 37º C e
na atmosfera de CO2 a 5%. Os oócitos são inseminados
com 100.000 a 200.000 espermatozóides móveis
por ml, após 4 a 6 horas da coleta. Em casos de oligozoospermia
grave e/ou astenozoospermia utiliza-se a técnica
de inseminação intracitoplasmática
(ICSI).
Observação da fertilização e
transferência de embriões
A clivagem embrionária é comprovada entre
40 a 42 horas da inseminação dos oócitos.
Geralmente, a limpeza dos oócitos é executada
com passagens sucessivas em agulha 27.5 G de uma seringa
de tuberculina. Os embriões devem ser classificados
de acordo Steer e cols. (1992) segundo suas características
morfológicas : Grau I - mais que 50% de fragmentação
dos blastômeros ou embrião em estágio
de pronúcleo. Grau II - 10 - 50% de fragmentação
dos blastômeros. Grau III - blastômeros irregulares
ou menos de 10% de fragmentação. Grau IV -
blastômeros regulares e simétricos. A transferência
deve ser realizada dentro de 40 a 42 horas de inseminação.
Os embriões são colocados cerca de 0.5 cm
abaixo da região fúndica do útero através
de cateter, anteriormente lavado com meio de cultura. Nunca
ultrapassar um volume de 50 ul. A transferência é
realizada em decúbito dorsal, permanecendo a paciente
nessa posição por três horas, antes
de deixar o ambulatório. Não é aconselhado
qualquer atividade física nas primeiras 24 horas
e o ato sexual é suspenso até a determinação
ou não da gravidez, apesar de cientificamente não
existirem evidências definitivas para essas condutas.
Apesar da impossibilidade de determinar o número
ideal de embriões para a serem transferidos, o Centro
de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá
Junqueira elaborou um protocolo que está em uso desde
janeiro de 1996 (Tabela 7.1). Fica claro que a decisão
final será do casal, após a exposição
dos riscos de multiparidade para cada faixa etária
e da situação clínica atual.
Tabela 7.1 - Número de embriões transferidos
segundo a idade e o padrão morfológico
Idade (anos) Número de embriões
< 30 02 (Lote com 1 embrião grau IV)
03 (Lote sem embrião grau IV)
31 a 35 04 (Lote sem embrião grau IV)
> 36 a 39 04 (Independente do grau)
> 40 04 ou mais (Discutir cada caso)
Análise dos resultados e futuras possibilidades
Apesar das diversas formas de avaliação da
eficiência das etapas que constituem o processo de
fertilização "in vitro", na verdade
os índices de gestação, especialmente
o parâmetro denominado de "bebê em casa"
(número de partos obtidos por ciclo de punção),
é o dado de maior significado (habitualmente no valor
médio de 15% por punção). As taxas
de gravidez por punção variam entre os diversos
serviços de reprodução assistida entre
20% a 30%, esse número é semelhante ao observado
em ciclos naturais nas mulheres sem problemas reprodutivos
(Franco Jr., 1985). O último Registro Latino-americano
referente ao ano de 1993 revelou que foram iniciados 3620
ciclos de estimulação ovariana para FIV na
América-Latina, realizando-se 3065 punções
aspirativas. Um total de 2537 transferência foram
executadas, resultando em 523 gestações clínicas,
com 383 partos com pelos menos um recém-nascido vivo.
Dessa forma, obteve-se um índice de cancelamento
de ciclos de 15.3%, uma taxa de gestação clínica
por punção de 17.1% e uma taxa de parto por
punção de 12.5%. Por outro lado, o Grupo Internacional
de Registro em Reprodução Assistida apresentou
na França (Montpellier, setembro, 1995), durante
o XV Congresso Mundial de Fertilidade e Infertilidade, os
resultados mundiais referentes ao ano de 1993. Com relação
ao programa de FIV analisou-se um total de 140477 punções
aspirativas com transferência embrionária em
116617, obtendo-se uma taxa de gravidez clínica de
19.9% por punção e um índice de parto
por punção de 14.8%. Em 1995, a Sociedade
Americana de Medicina Reprodutiva apresentou os resultados
de FIV nos Estados Unidos referentes ao ano de 1993. Um
total de 27.443 punções foram realizadas,
obtendo-se 18.3% de partos por punção. A incidência
de aborto foi de 19%. Atualmente, discute-se a possibilidade
de pacientes com hidrossalpinge unilateral ou bilateral
apresentarem taxas inferiores de gestação
nos programas de FIV do que aquelas com salpingectomia bilateral.
Kassabji e cols. (1994) comprovaram num programa de FIV
que pacientes com hidrossalpinge apresentaram uma taxa gestação
inferior e um alto índice de aborto quando comparadas
com aquelas com salpingectomia bilateral. Entretanto, Sharara
e cols. (1996) analisaram a performance no programa de FIV
de 63 pacientes com hidrossalpinge e 60 sem essa lesão.
As pacientes com títulos sanguíneos elevados
para 'Chlamydia trachomatis" usaram antibióticos
antes do procedimento de FIV. As taxas de implantação
embrionária e de gestação foram superiores
no grupo sem hidrossalpinge (12.6% e 33.7%) do que no com
hidrossalpinge (9.8% e 24.8%), entretanto, a diferença
não foi estatisticamente significativa. Apesar dos
inúmeros progressos do programa de FIV, as taxas
de implantação não se modificaram de
forma significativa com o decorrer do tempo. Recentemente,
Polak de Fried e cols. (1993) preconizaram o uso de regimes
com altas doses de corticóides (metil-prednisona
: 60 mg por dia, do dia da coleta de óvulos até
um dia após a transferência dos embriões)
com finalidade de aumentar a taxa de implantação
de embriões não manipulados. Os resultados
iniciais foram animadores, porém há necessidade
de posterior confirmação por outros autores.
Moffitt e cols. (1995) num estudo prospectivo, randomizado
e duplo-cego usando doses baixas de glicocorticóides
(6-alfa-metilprednisolona, na dose de 16 mg por dia, durante
4 noites iniciando na noite da coleta de óvulos)
não observaram qualquer efeito positivo nas taxas
de gestação. A micromanipulação
dos embriões através de processo mecânico,
químico ou laser, provocando uma abertura na zona
pelúcida poderia aumentar as taxas de implantação
embrionária (Cohen e cols. 1990; Strohmer e cols.,
1992). Stein e cols. (1995) usaram a técnica de dissecção
parcial da zona pelúcida em pacientes com falhas
repetidas de implantação, observando que esse
procedimento foi eficiente nas pacientes com mais de 38
anos e que relataram no mínimo 3 falhas de implantação
em prévios ciclos de FIV (grupo de estudo : taxa
de gestação de 23.9%; grupo controle : taxa
de gestação de 7%). Por outro lado, alguns
preconizam o uso de cocultura de embriões como uma
forma de melhorar a qualidade dos embriões formados,
reduzindo a fragmentação embrionária
e aumentando as taxas de gestação e implantação
(Thibodeaux e Godke, 1995). Do ponto de vista obstétrico,
os níveis de cesariana giram de 47% até 56%,
motivados em parte pela alta taxa de gestação
múltipla, apresentações pélvicas
em pré-termo, má história reprodutiva
ou mesmo idade materna avançada. Não há
predominância de sexo entre os recém-nascidos,
os índices de relação sexo masculino
e feminino variam em gestação única
de 1.00 / 1.00, gêmeos 1.22 / 1.00 e triplos 0.88
/ 1.00. A taxa de recém-nascidos de baixo peso é
elevada (34.8%), estando associada com a multiparidade e
prematuridade. A incidência de malformações
fetais giram em torno de 2.3% porém não foram
detectadas anormalidades específicas, sejam cromossômicas,
ou não. Finalmente, as gestações oriundas
de FIV apresentam uma maior incidência de prenhez
ectópica e aborto espontâneo, do que a população
geral. As complicações obstétricas
decorrentes da multiparidade como a prematuridade e o baixo
peso, também mostram uma maior frequência do
que na população controle. O crescimento fetal
na gestação, as malformações
fetais e o rateio entre os sexos dos recém-nascidos
não diferem aos da concepção natural.
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