Análise do Sêmen para Reprodução
Assistida
A
análise do sêmen constitui-se na pedra básica
da avaliação do fator masculino em reprodução
assistida. O espermograma convencional inclui o estudo de
aspectos particulares da função espermática
como a concentração, motilidade e morfologia,
assim como, na quantificação e identificação
de células não espermáticas, anticorpos
antiespermatozóides e testes de penetração.
A amostra de sêmen deve ser coletada através
de masturbação, em frasco estéril,
de plástico ou vidro, após abstinência
sexual mínima de 48 horas. A amostra será
colhida em sala próxima ao laboratório de
análise. Não sendo possível, a coleta
poderá ser realizada em outro local, porém
o tempo de entrega do material para estudo, não deve
ser superior a 30 minutos. Assim como, a temperatura ideal
para transportar o material estaria entre 20º C e 37º
C. Rotineiramente, a amostra será identificada com
o nome do paciente, data e horário da coleta. Por
outro lado, o paciente deve relatar qualquer perda de material
durante o ato de coleta, ou quadro febril recente (últimos
3 meses). Uma avaliação ideal da função
espermática baseia-se na análise de três
amostras de sêmen.
Análise Macroscópica
Aparência, cor e liquefação
A amostra de sêmen normal possui cor branca opalescente,
sendo homogênea e se liquefaz `a temperatura ambiente
em menos de 60 minutos. A amostra pode conter grânulos
gelatinosos, os quais não se liquefazem, e neste
caso, será considerada heterogênea. Um aumento
da viscosidade ou consistência poderia interferir
no processo de determinação da concentração
dos espermatozóides. A amostra que possui uma coloração
marrom indicaria a presença de glóbulos vermelhos.
Em geral, as amostras com filamentos de muco que comumente
acarretam uma incompleta liquefação, devem
ser submetidas a um processo mecânico de liquefação
pela passagem através de uma agulha de 19 G ou por
processo químico pelo uso da bromelina (concentração
de 1g por litro).
pH.
Uma vez liquefeita a amostra de sêmen, coloca-se uma
aliquota sobre o papel de pH (faixa de pH 6.1 a 10), e observa-se
após 30 segundos a cor obtida, que será comparada
com a fita de calibração colorimética
de pH. O pH é determinado pelas secreções
da próstata (ácida) e vesícula seminal
(básica). A medida do pH será executada dentro
do período de 1 hora da coleta do sêmen, e
normalmente, varia entre 7.2 e 7.8. Obrigatoriamente, as
amostras com pH superior a 7.8 devem ser avaliadas quanto
a presença de infecção. Em caso de
pH menor que 6.5, pode se levantar a suspeita de agenesia,
ou oclusão das vesículas seminais.
Viscosidade
A viscosidade ou consistência da amostra liquefeita
pode ser estimada por gentil aspiração do
sêmen em pipetas de 5 ml, seguida de fácil
gotejamento. Dessa forma, a amostra será classificada
como normal quando gotas são formadas. No caso de
viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento
a formação de um filamento de mais de 2 cm.
O aumento da consistência pode estar relacionado com
disfunção prostática por inflamação
crônica. A consistência anormal também
pode intervir na avaliação de várias
características do sêmen, tais como a motilidade,
concentração ou determinação
de anticorpos antiespermatozóides.
Volume
O volume do ejaculado será medido em cilindros, pipetas
ou seringas graduadas, considera-se um volume normal de
2.0 a 5.0 ml. A maior parte do volume é secretada
pela vesícula seminal, sendo que a próstata
produz entre 0.5 a 1 ml. Um volume acima de 5 ml é
suspeito de infecção aguda nas glândulas
anexas e quando inferior a 1.5 ml sugestivo de processo
inflamatório crônico ou ejaculação
retrógada.
Análise Microscópica
A análise microscópica inicial da amostra
de sêmen consta do estudo da concentração,
motilidade, morfologia, vitalidade, citologia geral, e dos
testes de penetração espermática e
hiposmótico.
Concentração
Atualmente, a concentração dos espermatozóides
é medida através de câmaras de contagem
(Makler, Horwell, Neubauer, etc). A câmara de Makler
possui uma profundidade de 0.01 mm e uma marcação
graduada de 100 quadrados (área total de 1 mm2) cada
um com 0.1 mm x 0.1 mm. Assim sendo, o volume compreendido
na área de 10 quadrados após a colocação
da lamínula é de 0.001 mm3 ou 1 milhão
por ml (Figura 3.1). Tal fato, facilita a leitura direta
da concentração da amostra de sêmen
(milhões por ml) pela simples contagem dos espermatozóides
presentes na área de 10 quadrados. Em geral, coloca-se
um volume de 10u l de esperma liquefeito no centro da câmara
de Makler, adapta-se a lamínula e realiza-se a contagem
em microscopia de fase em aumento de 200 vezes (Figura 3.2).
Habitualmente, a concentração dos espermatozóides
é definida segundo as normas da Organização
Mundial de Saúde (WHO, 1992) : A. Normozoospermia
: > 20 x 106 espermatozóides/ml. B. Oligozoospermia:
< 20 x 106 espermatozóides/ml. C. Polizoospermia
: > 200 x 106 espermatozóides / ml. D. Azoospermia
: nenhum espermatozóide no ejaculado.
Motilidade
A motilidade também é realizada em câmara
de contagem com microscopia de fase e aumento de 200 vezes
. Uma alíquota de sêmen de 10u l deverá
ser depositada na câmara, executando-se uma contagem
de 100 espermatozóides, o processo será sempre
em duplicata. Caso ocorra uma diferença > 10%
entre as duas avaliações será executada
uma média das 3 observações que será
relatada como a motilidade final. A motilidade dos espermatozóides
será classificada segundo os padrões da Organização
Mundial de Saúde (WHO, 1992) : Tipo A - espermatozóides
móveis com progressão rápida. Tipo
B - espermatozóides móveis com progressão
lenta. Tipo C - espermatozóides móveis porém
sem progressão. Tipo D - espermatozóides imóveis.
Finalmente, a amostra de sêmen será considerada
normal ou anormal segundo o critério : Normal : >50%
do tipo A e B. Anormal : < 50% do tipo A e B.
Morfologia
A morfologia é realizada através da coloração
de Shorr e sua avaliação executada após
a análise de dois esfregaços de 10u l de sêmen
fresco. Um mínimo de 200 espermatozóides são
estudados no aumento de 1000 vezes (Figura 3.3). Os espermatozóides
são classificados quanto aos aspectos morfológico
em dois grupos : A- Normal : A cabeça será
levemente ovalada, única, lisa, sem gotas citoplasmáticas
e com o acrossoma ocupando cerca de 40% a 70% da cabeça.
O diâmetro varia de 3 a 5 um, podendo apresentar até
2 vacúolos citoplasmáticos. A peça
intermediária deve medir de 6 a 10 um, alinhar-se
com o eixo longitudinal da cabeça, e não apresentar
expansões laterais. A cauda será única
e desenrolada, com um tamanho de 45 um (Figura 3.4). B -
Anormal : 1. Defeitos no acrossoma : a. acrossoma pequeno
(< 40%). b. acrossoma grande (> 70%). 2. Defeitos
do corpo e peça intermediária : c. peça
intermediária larga. d. gota intracitoplasmática.
e. peça intermediária separada. 3. Defeitos
estruturais : f. piriforme. g. achatado. h. forma de ampulheta.
i. superfície irregular. j. mais que dois vacúolos
k. achatado no sítio de implantação
da cauda. l. não ovalada de um lado m. redonda. 4.
Defeitos da cauda : n. inserção. 0. espiralada.
p. ângulo > 90 . (Figura 3.5 - A a C) Além
disso, deve-se analisar as chamadas formas imaturas que
são definidas como células esféricas
que apresentam diâmetro nuclear entre 4 e 9 um e ausência
de cauda. A morfologia espermática normal segundo
a Organização Mundial de Saúde (WHO,
1992) é definida pela presença de formas normais
em 30% ou mais dos espermatozóides examinados. Todavia,
usando-se os critérios de Kruger (1986) baseado na
avaliação morfológica e subsequente
performance em fertilização "in vitro"
(FIV), define-se como morfologicamente normais os pacientes
que mostraram formas normais em >14% dos espermatozóides
analisados. A coloração de Shorr é
usada de rotina para avaliação da morfologia
espermática. Em geral dois esfregaços de sêmen
são preparados e após sua secagem na temperatura
ambiente, realiza-se a passagem nos seguintes reagentes
: 1. Álcool 70º por 15 minutos; 2.Água
corrente; 3. Corante de hematoxilina por 45 segundos; 4.
Água corrente; 5. Álcool 90º ; 6. Corante
de Shorr por 5 minutos; 7. Álcool 95º (3 passagens
sucessivas); 8. Álcool absoluto (3 passagens sucessivas);
9. Alcool - xilol (1:1); 10. Xilol (2 passagens sucessivas).
Vitalidade
A vitalidade será avaliada através da combinação
dos corantes eosina e nigrosina em esfregaço de sêmen
fresco. Esta técnica baseia-se no fato de que as
células mortas apresentam membranas lesadas que permitem
a penetração de corantes. Uma contagem de
100 espermatozóides deverá ser realizada em
microscópio comum com aumento de 1000 vezes de forma
a diferenciar as células vivas (não coradas)
das mortas (coradas). Inicialmente, pipeta-se num tubo o
volume de 100 ul de sêmen, adicionando-se duas gotas
de eosina, e homogeiniza-se a solução por
30 segundos. Em seguida, adiciona-se 4 gotas de nigrosina,
homogeiniza-se por 45 segundos e executa-se um esfregaço
que após a secagem é submetido a uma análise
microscópica em aumento de 1000 vezes. O resultado
é apresentado na porcentagem total dos espermatozóides
vivos (não se coram). Lembrar que os espermatozóides
mortos coram-se de vermelho. As substâncias usadas
para a determinação da vitalidade são
as seguintes : 1. Eosina amarela (Merck) na concentração
de 3% em solução fisiológica. Estocar
na temperatura ambiente; 2. Nigrosina hidrossolúvel
(Merck) na concentração de 8% em solução
fisiológica. Filtrar e estocar na temperatura ambiente.
Teste hiposmótico
A finalidade deste teste é avaliar a integridade
funcional da membrana celular dos espermatozóides
quando estes são colocados em uma solução
hiposmótica. Inicialmente, ocorre uma entrada de
líquido para o interior da célula com a finalidade
de se estabelecer o equilíbrio osmótico. Como
resposta a esse fato, a membrana dos espermatozóides
incha-se formando espaços líquidos na cauda
dos espermatozóides. A presença de inchaço
indicará que o transporte de fluidos através
da membrana ocorreu normalmente, sendo esta, considerada
íntegra do ponto de vista funcional. Assim sendo,
uma solução de 150 mOsm/l é obtida
com um meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc) diluido
em água destilada (1/1). Em seguida, coloca-se 1.0
ml da solução hiposmótica num tubo,
e incuba-se na temperatura de 37º C por 10 minutos.
O sêmen liquefeito num volume de 100 ul é depositado
no tubo, e o conjunto incubado por 30 minutos na temperatura
de 37º C. Finalmente, retira-se uma alíquota
de 10 ul da suspensão de esperma, e observa-se um
mínimo de 200 espermatozóides em microscópio
de fase com aumento de 200 vezes. O cálculo da porcentagem
de espermatozóides que apresentam inchaço
na cauda é determinado pela relação
: THO (%) = Número de espermatozóides com
inchaço x 100/Total de espermatozóides contados
A amostra de sêmen será considerada normal
quando mais que 60% dos espermatozóides apresentarem
inchaço de cauda (Figura 3.6). O significado do teste
hiposmótico na previsão da fertilidade masculina
ainda é controvertido. Alguns grupos relatam uma
pobre correlação entre o teste hiposmótico
e os resultados posteriores em FIV (Barrat e cols., 1989,
Jager e cols., 1991). Entretanto, Uchida e cols. (1992)
mostraram que o teste hiposmótico é efetivo
na avaliação da capacidade de fertilização
dos espermatozóides quando é usada a técnica
de sedimentação-migração ("swim-up")
como método de capacitação dos espermatozóides.
Em 1988, Liu e cols. selecionaram espermatozóides
móveis e utilizaram uma análise de regressão,
não achando correlação entre os escores
do teste hiposmótico no sêmen (ou após
"swim-up") e a fertilização de oócitos
"in vitro". Franco Jr. e cols. (1995a) apesar
de empregarem o método de "swim-up" verificaram
que o teste hiposmótico não foi eficaz na
identificação de uma população
masculina com posterior falha total de fertilização
ou em diferenciar aquela com taxas de clivagem 50% daquela
com valores < 50%. Além disso, coeficiente de
correlação "pi" entre os valores
do teste hiposmótico e a taxa de clivagem embrionária
foi fraco ( = 0.19).
Exame citológico
O sêmen também possui outras células
além dos espermatozóides, tais como as células
epiteliais poligonais do trato uretral, células espermatogênicas,
leucócitos e hemácias. A concentração
destas células na amostra, pode ser estimada na câmara
de Makler, por ocasião da contagem dos espermatozóides.
Nos casos em que a amostra de sêmen apresentar uma
concentração de leucócitos superior
a 1 x 106 por ml, deve-se avaliar a possibilidade de o paciente
possuir qualquer infecção nas glândulas
sexuais acessórias. Em seguida, afastar a presença
de protozoários (Trichomonas vaginalis) ou fungos
(Candida albicans).
Teste de penetração espermática
O teste de penetração espermática tem
como finalidade medir a habilidade dos espermatozóides
penetrarem no muco cervical, ou qualquer fluido substitutivo,
como o muco bovino, clara de ovo, etc. Em virtude da dificuldade
da obtenção rotineira do muco cervical humano,
executa-se em nosso laboratório o chamado teste de
penetração na clara do ovo. Inicialmente,
um volume da clara do ovo é aspirado através
de uma seringa e avaliado quanto ao pH, ajustando-se o mesmo
entre 7.0 e 7.5 através de uma solução
tampão com Hepes (0.119 g/10ml, Sigma H-6147). O
teste de penetração na clara do ovo é
realizado em capilar plano (Microslides, Vitro Dynamics
Inc., USA), preenchido com clara de ovo, vedado na extremidade
superior e colocado verticalmente em contato com sêmen
liquefeito (200 ul). Em seguida, incuba-se na temperatura
de 37º C por 90 minutos. A penetração
dos espermatozóides é avaliada por um sistema
graduado em milímetros utilizando-se um microscópio
de contraste de fase com um aumento de 400 vezes. O teste
de penetração é considerado normal
quando o espermatozóide vanguardeiro atingiu ou ultrapassou,
o valor de 30mm (Figura 3.7). Franco Jr. e cols. (1995b)
testaram a hipótese de que o teste de penetração
dos espermatozóides na clara do ovo (TPECO) poderia
identificar uma população masculina com maior
probabilidade de fertilizar oócitos em cultura. O
TPECO foi executado num total de 70 amostras de esperma
durante a investigação prévia ao programa
de FIV; posteriormente os 70 pacientes e suas esposas participaram
do programa de FIV. O nível médio de clivagem
embrionária foi de 68 ± 33.6%. A sensibilidade
do TPECO foi de 0.62, a especificidade de 0.85, o valor
preditivo do teste anormal de 0.35, e o valor preditivo
do teste normal de 0.95 quando usado para avaliar a habilidade
da população masculina formar embriões.
A eficácia (0.73) foi próxima da obtida com
a análise morfológica dos espermatozóides
(0.79). Por outro lado, quando diferentes parâmetros
do sêmen (concentração, morfologia e
motilidade) e o TPECO foram comparados em termos de poder
identificar populações com >50% ou <50%
de níveis de clivagem embrionária, apenas
a morfologia e o TPECO mostraram significativa correlação
com a taxa posterior de clivagem embrionária. Em
conclusão, o TPECO pode identificar uma população
masculina com maior probabilidade de fertilizar oócitos
em cultura.
Teste do hamster
Desde o trabalho pioneiro de Yanagimachi (1976) que demonstrou
a possibilidade da penetração dos espermatozóides
humanos nos oócitos de hamster, diversos laboratórios
têm usado esse método na investigação
do fator masculino em infertilidade. Essa técnica
avalia a capacidade de penetração dos espermatozóides
"in vitro" sem o uso de oócitos humanos.
Entretanto, uma análise da literatura identifica
uma dificuldade no estabelecimento das condições
padrões para esse teste (Rogers e cols., 1979; Cohen
e cols., 1982). Em linhas gerais. o método propicia
o conhecimento de inúmeras variáveis que participam
do processo de interação dos gametas "in
vitro", apesar das ressalvas quanto a complexidade
e elevado custo na sua instalação e manutenção.
Em síntese, o sêmen é colhido após
masturbação sendo submetido ao processo de
capacitação laboratorial. Os espermatozóides
ativados são incubados na temperatura de 37º
C com a finalidade de completarem o tempo ideal de capacitação
(teste curto : 3 a 4 horas; teste longo : 18 a 20 horas).
Em seguida, selecionam-se fêmeas adultas de hamster
que são submetidas ao método de estimulação
ovariana com gonadotrofinas para a obtenção
de uma superovulação. O "cumulus oophorus"
é retirado com a abertura dos ovidutos e submetidos
à ação da hialuronidase (0.1%). Tal
fato permite a liberação de inúmeros
oócitos. Numa próxima etapa, os oócitos
são colocados sob a ação da tripsina
(0.1%) e perdem sua zona pelúcida, fator limitante
para a fertilização interespécie. Habitualmente,
entre 25 e 30 oócitos são incubados com uma
concentração de 2 a 10 milhões de espermatozóides
móveis por ml, durante o período de duas horas
(teste curto). Após esse período, o fenômeno
de fertilização é determinado pela
presença de espermatozóides com cabeça
aumentada (inchaço cefálico) dentro do oócito
(Franco Jr. e cols., 1988). Com respeito aos critérios
de interpretação do teste do hamster numa
população masculina fértil, ainda permanecem
dúvidas pois, enquanto Rogers e cols. (1979) consideram
como normal o paciente que apresenta índices de fertilização
iguais ou superiores a 15%, Hall (1981) e Werlin e cols.
(1985) referem limite inferior de normalidade o valor de
20%, e validam o teste com um mínimo de três
exames repetidos com intervalo de tempo apropriado. A especificidade
do teste do hamster é relativamente boa, entretanto,
sua sensibilidade na seleção das populações
inférteis não é das melhores, ou seja,
24.2%. O critério rigoroso na definição
do valor anormal do teste de hamster é fundamental,
pois situações clínicas reversíveis,
como a piospermia no líquido seminal, podem alterar
de forma passageira os índices de fertilização
dos oócitos (Berger e cols., 1982). Outro aspecto
de real interesse, seria a determinação do
verdadeiro papel do teste do hamster na previsão
da capacidade de fertilização dos espermatozóides
humanos quando colocados em contacto com os oócitos
das esposas. Hall e cols., (1983) analisando uma população
masculina que participava de um programa de FIV, observou
que os maridos com índices de fertilização
superiores a 14% fertilizaram, no mínimo, um oócito.
Ao contrário, aqueles com índices inferiores
a 14% falharam em fertilizar os óocitos em 80% das
vezes. Foreman e cols. (1984) verificaram que nove homens
de um total de quinze que falharam em fertilizar os oócitos
de sua esposa "in vitro", conseguiram fertilizar
os oócitos do hamster. Enfim, o valor clínico
do teste do hamster na identificação do homem
infértil, tanto na previsão da gravidez "in
vitro" quanto "in vivo" ainda não
está bem estabelecido. Além disso, é
provável que outros testes mais simples de previsão
do poder dos espermatozóides fertilizar oócitos
"in vitro" (Franco Jr. e cols., 1993) possam apresentar
sensibilidade e especificidade idêntica, ou superior,
ao teste do hamster. Do ponto de vista clínico, a
introdução da injeção intracitoplasmática
dos espermatozóides (ICSI) causou uma diminuição
geral no uso de testes de previsão da fertilização
de oócitos em cultura como rotina na avaliação
prévia ao emprego de técnicas de reprodução
assistida.
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