Criopreservação de embriões e gametas
Princípios
básicos da criopreservação
Os primeiros estudos de Whittingham e cols. (1972) mostraram
que o congelamento lento de embriões de camundongo
nas fases iniciais de clivagem, na presença de dimetil-sulfóxido
(DMSO), seguido de um processo lento de descongelamento,
não afetava a sobrevida dos embriões e seu
futuro desenvolvimento. Em 1983, Trounson e Mohr obtiveram
uma gestação clínica após criopreservarem
pela primeira vez embriões humanos usando uma variação
deste método. Em seguida, diversos grupos relataram
a eficácia desta metodologia (Zeilmaker e cols.,
1984; Mohr e cols., 1985; Trounson, 1986). Habitualmente,
quando um líquido está sendo congelado, a
temperatura poderá cair abaixo de 0º C, neste
momento o gelo é formado e a temperatura retorna
a 0º C, até que o líquido seja totalmente
congelado. Nesse processo em que a temperatura do líquido
pode ser reduzida abaixo do ponto de congelamento sem a
solidificação do líquido, ocorre uma
liberação do calor de fusão necessário
para formar a estrutura molecular da água sólida.
O sucesso da criopreservação da célula
depende da velocidade do congelamento e da composição
da solução, onde as células são
congeladas. Inicialmente, a água extracelular congela,
no momento em que a célula se aproxima do ponto de
congelamento, removendo o líquido extracelular, fato
que acarreta um aumento de osmolaridade. Com esse desiquilíbrio
osmótico, a água é retirada da célula
para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuição
do volume celular. Uma adequada desidratação
celular depende da velocidade do congelamento de forma a
não provocar uma lise da célula. No caso de
um congelamento muito lento, o equilíbrio permanecerá
constante e a célula ficará exposta ao crioprotetor
e ao estresse osmótico por tempo prolongado, fato
que poderá acarretar a morte celular. Ao contrário,
no caso de congelamento muito rápido, a desidratação
será insuficiente e causará a formação
de gelo intracelular ocasionando a lise da célula
na ocasião do descongelamento (Lopez-Bejar e cols.,
1994). Para evitar o dano celular, mesmo com uma velocidade
de descongelamento controlada, há necessidade do
emprego de crioprotetores (Figura 9.1).
Crioprotetores
Em geral, os protocolos para criopreservação
de embriões humanos acompanharam os desenvolvidos
para congelamento de embriões de camundongo, entretanto,
algumas modificações foram introduzidas, como
novos crioprotetores e a adição de sucrose
para a desidratação dos embriões antes
do congelamento e para o auxílio na remoção
dos crioprotetores (Lassalle e cols., 1985; Cohen e cols.,
1986). O emprego dos crioprotetores tem como objetivo melhorar
a taxa de sobrevida das células durante o processo
de congelamento e descongelamento. Podem ser divididos em
dois grupos : extracelulares (sacarose, polivinilpirrolidina
= PVP, dextran), e intracelulares (glicerol, DMSO, propanodiol
= PROH). A ação crioprotetora é de
difícil explicação, entretanto, admite-se
que uma das principais seria diminuir o ponto de congelamento
da solução. Por exemplo, com o DMSO, a formação
de gelo intracelular ocorrerá somente nas baixas
temperaturas entre -40º C e -50º C. A permeabilidade
da membrana varia entre os diferentes estágios do
desenvolvimento celular ou embrionário, tal fato
acarreta a utilização de um crioprotetor para
cada situação específica. Dessa forma,
emprega-se no congelamento de oócitos DMSO e PROH,
de zigotos ou embriões, de 2 a 4 células o
PROH e em embriões de 8 a 16 células o DMSO,
em caso de blastocistos, o glicerol e DMSO. Freqüentemente,
os crioprotetores são tóxicos para as células
(o propanodiol é o menos tóxico dos crioprotetores).
Alguns autores relataram uma atividade partenogênica
com o uso de propanediol (Van der Elst e cols., 1988). Van
der Elst e cols. (1995) em estudo prospectivo e randomizado
mostraram, num programa de fertilização "in
vitro" (FIV), que o DMSO é superior ao PROH
na criopreservação de embriões humanos
excedentes. O índice de sobrevida embrionário
foi para o protocolo com DMSO de 52.6% versus 32% para aquele
com PROH. A taxa de gestação clínica
para as transferências com uso de DMSO foi 17.2%,
significativamente maior do que a de 3.9% obtida com PROH.
Finalmente, devem ser analisados antes da definição
do agente de criopreservação : 1. O tipo de
célula que será criopreservada. 2. A concentração
do crioprotetor. 3. A toxicidade específica 4. O
tempo de equilíbrio.
Procedimentos de congelamento e descongelamento
Geralmente, três procedimentos de criopreservação
celular podem ser usados : lento, rápido e ultra-rápido.
No lento, a velocidade de congelamento é de 0.3º
C por minuto do "seeding" até aproximadamente
-80º C, antes de mergulhar o material em nitrogênio
líquido. A duração do congelamento
variará de 3.5 a 4 horas. O descongelamento é
feito na velocidade de 10º C por minuto. No rápido,
a velocidade de congelamento é de 0.3º C do
"seeding" até -30º C. A duração
do congelamento situa-se entre 2 a 2.5 horas. O descongelamento
é feito na velocidade de 30º C por minuto. O
equipamento usado nestes procedimentos é um "freezing"
programável. No ultra-rápido e na vitrificação,
a velocidade de congelamento será de 2500º C
por minuto. A duração do congelamento ficará
entre 2 a 3 minutos, e a velocidade de descongelamento >
300º C por minuto. A vitrificação é
a solidificação do líquido sem ocorrer
a formação de gelo (cristalização),
devido ao aparecimento de uma viscosidade elevada durante
a fase de congelamento. Assim sendo, no congelamento de
soluções contendo altas concentrações
de crioprotetor, esta torna-se viscosa durante sua passagem
do estado líquido para o estado sólido não
estruturado. Para a obtenção da vitrificação,
as soluções de crioproteção
devem ser aumentadas em 40% na relação peso/volume.
Em 1988, Trounson e Sjöblom descreveram a obtenção
de gestações após a transferência
de embriões humanos criopreservados em altas concentrações
de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), por 2 a 3 minutos, com
subseqüente conservação em nitrogênio
líquido. O descongelamento foi rápido na temperatura
de 37º C. A principal vantagem nessa metodologia seria
não requerer o uso da aparelhagem de congelamento,
além da velocidade na sua execução.
O método ultra-rápido é um método
simples e barato para a criopreservação de
embriões humanos. Barg e cols. (1990) relatam uma
taxa de gestação clínica por transferência
de 10.5% para embriões criopreservados pelo método
ultra-rápido. A atividade biológica celular
pode ser conservada indefinidamente em nitrogênio
líquido. Apesar de possíveis reações
fotofísicas previsíveis em temperatura de
-196º C, contudo, experimentos executados em camundongos
negam a presença de danos genéticos.
Variáveis que afetam os resultados clínicos
do processo de criopreservação embriões
Em geral, os fatores que influenciam a eficácia da
transferência de embriões a fresco (idade da
paciente, qualidade e número de embriões),
também afetariam as taxas de gestações
obtidas com embriões descongelados. Acredita-se que
o congelamento de embriões morfologicamente classificados
como de melhor qualidade poderia acarretar uma possibilidade
de maior sucesso após o processo de descongelamento
e transferência embrionária. A distribuição
equitativa entre embriões de mesma qualidade para
transferência a fresco, ou para o processo de congelamento,
teria influência significativa nas taxas de gravidez
de um programa de criopreservação de embriões.
A proporção de ciclos de FIV que necessitam
de criocongelamento varia em função do grau
de estimulação ovariana e da política
de transferência embrionária. O sucesso na
transferência de embriões criopreservados aumentaria
a eficácia final de um único ciclo de estimulação
ovariana. Atualmente, dois esquemas hormonais são
usados para a transferência de embriões descongelados
: 1. Ciclo natural. 2. Ciclo artificial com bloqueio ovariano
com análogos de GnRH (GnRH-a) + associação
hormonal com estrógeno e progesterona. Tucker e cols.
(1995) acreditam que não há diferença
nas taxas de gravidez quando os embriões descongelados
são transferidos em ciclos naturais ou naqueles com
reposição hormonal pós-bloqueio ovariano
com GnRH-a. Queenan e cols. (1994) realizaram 628 transferência
de embriões descongelados, resultando uma taxa de
gestação em ciclo natural de 18% versus em
ciclo artificial de 22%. Irianni e cols. (1992) referem
taxas de gravidez por transferência de embriões
descongelados de 22%. Heijnsbroek e cols. (1995) publicaram
uma taxa de parto por transferência embrionária
de 10%, fato que elevou sua taxa de bebê em casa por
procedimento (fresco + descongelado) em 6%. Lin e cols.
(1995) demonstraram que o sucesso da transferência
de embriões descongelados é significativamente
maior na população cujas pacientes engravidaram
na transferência a fresco, do que naquelas que não
obtiveram gestação previamente. Wada e cols
(1994) observaram uma incidência de malformações
maiores em 1% dos recém-nascidos cujas gestações
foram conseguidas pela transferência de embriões
criopreservados, tal valor é inferior aos relatados
para os programas de FIV com transferência de embriões
a fresco. A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva
(1995) refere que no ano de 1993 nos Estados Unidos, um
total de 234 programas realizaram transferência de
embriões criopreservados. Assim sendo, um total de
6194 transferência de embriões resultaram em
984 gestações, ou seja, 15.9% de gestações
por transferência, obtendo-se um índice final
de parto de 11.9% por transferência de embriões
descongelados. Além disso, Van Voorhis e cols. (1995)
relataram um acréscimo sobre as taxas de gestação
por punção a fresco de 6.6%. Frederick e cols.
(1995) estudaram 36 pacientes que criopreservaram todos
os embriões obtidos no ciclo a fresco, em virtude
do alto risco para o desenvolvimento de síndrome
de hiperestimulação ovariana ou que possuiam
endométrio inferior a 8 mm de espessura. A criopreservação
foi realizada com PROH 1.5M, no estágio de pronúcleo
ou embrião de duas células. A transferência
embrionária pós-descongelamento foi executada
em ciclos com reposição hormonal em 70% dos
casos e em ciclo natural em 30%. Obteve-se uma taxa de gravidez
por ciclo de transferência de 33% e um índice
de parto por transferência de 28.6%. A taxa de implantação
foi de 9.1%. Kaufmann e cols. (1995) observaram que a criopreservação
de blastocistos após cultivo em sistema de co-cultura
poderia produzir índices de gravidez por transferência
de embriões descongelados de 21.7% e de gestações
clínicas de 19%. O sucesso da criopreservação
de embriões submetidos a ICSI ainda é motivo
de dúvidas. Van Steirteghem e cols. (1994), criopreservando
embriões excedentes provenientes de ciclos após
ICSI, verificaram que 53% dos embriões descongelados
sobreviveram, obtendo-se uma taxa de gestação
clínica por transferência de 12.9% e um índice
de partos por transferência de 5.9%. Ao contrário
do programa FIV do mesmo serviço com a mesma técnica
de criopreservação, conseguiram uma taxa de
sobrevivência de 51%, com um índice de gestação
clínica por transferência de 10.7% e um índice
de parto por transferência de 7.1%. A incidência
de aborto pré-clínico para as pacientes de
ICSI foi de 40.9% e para as de FIV de 27%. Uma explicação
para a alta incidência de aborto pré-clínico
em gestações obtidas através de embriões
criopreservados após ICSI ainda não ficou
clara. Al-Hasani e cols. (1996) compararam a performance
de lotes embrionários obtidos após FIV convencional
ou ICSI ambos congelados na fase de pronúcleo. Os
dados não evidenciaram diferenças significativas
nas taxas de gravidez após transferência embrionária
entre o grupo de FIV (17%), e o de ICSI (20%). Entretanto,
a criopreservação de embriões poderá
acarretar inúmeros problemas de natureza ética,
especialmente os ligados com situações de
morte, doença incapacitante de um dos integrantes
do casal, divórcio ou possíveis desacordos
quanto ao destino que possa ser dado aos embriões
não utilizados com o decorrer do tempo.
Método de congelamento ultra-rápido para criopreservação
de embriões
No Brasil, não há publicações
relatando gestações após criopreservação
de embriões por qualquer metodologia. Franco Jr.
e cols. (1994) relataram pela primeira vez a obtenção
de uma gestação clínica após
criopreservação e descongelamento de embriões
pelo método ultra-rápido.
O método ultra-rápido descrito por Trounson
e cols. (1987) consta das seguintes soluções
:
1. Preparo das soluções (Figura 9.2) :
2. Solução A
Menezo B2, IVF-50..................... 4.0 ml
Soro inativado da paciente........... 1.0 ml
3. Solução B
Solução A ................................
3.935 ml
DMSO (14.079 M) ...................... 1.065 ml
4. Solução de congelamento :
Pesar 0.428 g de sucrose e colocar num tubo graduado de
15 ml (Corning), completar para 5.0 ml com a solução
B (solução final possui 3.0 M de DMSO e 0.25
M de sucrose). Filtrar a solução final em
membrana de 0.22 m e depositar em tubo estéril (Corning).
Gasificar com uma mistura de N2 a 90%, CO2 a 5% e O2 a 5%.
Manter a solução de congelamento na temperatura
de 4º C, pelo período mínimo de 24 horas
e no máximo de 72 horas.
5. Soluções de descongelamento :
Pesar 0.428 g de sucrose, colocar em tubo de graduado de
15 ml (Corning), completar para 5.0 ml com a solução
A (a solução final possui 0.25 M de sucrose).
Filtrar a solução com membrana de 0.22 m e
gasificar com uma mistura de N2 a 90%, CO2 a 5% e O2 a 5%.
Essa solução mãe deve ser preparada
no dia do descongelamento e mantida na temperatura ambiente.
Em seguida, preparar 3 soluções de descongelamento
: Solução I (solução mãe
2 ml + solução A 1ml); Solução
II (solução mãe 1 ml + solução
A 1ml); Solução III (solução
mãe 1ml + solução A 2 ml).
Técnica de congelamento
Retirar os embriões da solução A e
colocá-los em placa de Falcon contendo solução
de congelamento. Transferir os embriões para as "paillettes"
(previamente identificadas com o nome da paciente e data
do congelamento) preenchendo-as conforme a sequência
: meio, ar, meio + embriões, ar, meio (Figura 9.3).
Selar a "paillette" na extremidade do algodão
utilizando a própria solução de congelamento
e pó selante. Os embriões devem ficar expostos
na solução de congelamento por 2.5 minutos
na temperatura ambiente, tempo necessário para o
equilíbrio com o crioprotetor, (incluindo o tempo
de preenchimento da "paillettes"). Finalmente,
as "paillettes" acomodadas em raqui são
mergulhadas em recipiente contendo nitrogênio líquido.
Técnica de descongelamento
Retirar a "paillette" do nitrogênio líquido
e mergulhar em banho-maria `a temperatura de 37º C
por 6 segundos. Enxugar a "paillette" e cortar
uma das extremidades. Expulsar da "paillette"
a solução de congelamento mais os embriões
com o auxílio de uma seringa de 1.0 ml, colocando-os
na temperatura ambiente por 10 minutos em cada uma das soluções
de descongelamento I, II e III (Figura 9.4). Em seguida,
transferir os embriões para a solução
A, pré-aquecida (37º C) e incubar em atmosfera
de CO2 a 5% e temperatura de 37º C por tempo mínimo
de 3 hora, após o que será realizada a transferência
embrionária.
Criopreservação de oócitos
A criopreservação de oócitos humanos
ainda é uma metodologia em desenvolvimento, apesar
de algumas gestações pós-descongelamento
terem sido descritas em meados da década de oitenta
(Chen, 1986; Al-Hasani e cols., 1987; Van Uem e cols., 1987).
Acredita-se que o fuso tubular do oócito maduro é
sensível para as mudanças de temperatura e
não disjunções de cromátides
podem ocorrer durante o processo de congelamento, resultando
em aneuploidias após a fertilização
(Van der Elst e cols., 1988; Pickering e cols., 1990). Alguns
também referem um aumento da liberação
de grânulos corticais que levariam a um endurecimento
da zona pelúcida (Trounson e Kirby, 1989). Até
o momento, não é satisfatória a taxa
de sobrevida dos oócitos humanos descongelados, os
índices de sucesso variam de 27% a 64% (Todorow e
cols., 1989; Imoedemhe e Sigue, 1992; Gook e cols., 1993).
Gook e cols. (1994) verificaram uma taxa de sobrevida dos
oócitos de 51% logo após o descongelamento,
entretanto, houve uma queda para 41% quando nova observação
foi realizada após 3-4 horas. Em geral, os índices
de fertilização dos oócitos descongelados
são inferiores aos obtidos com a inseminação
a fresco e uma incidência alta de fertilização
anormal tem sido descrita (Al-Hasani e cols., 1987). Kazem
e cols. (1995) referem uma taxa de fertilização
de oócitos descongelados de 45.9% quando submetidos
a ICSI versus 13.5% por FIV convencional. Gook e cols. (1995)
referem resultados idênticos quanto a presença
de fertilização normal entre oócitos
criopreservados após inseminação (34%
= 26 oócitos descongelados/9 fertilizações
normais) versus aqueles onde a ICSI foi empregada (35% =
20 oócitos / 7 fertilizações normais).
Kazem e cols. (1992) afirmaram que os índices de
fertilização de oócitos humanos maduros
pré-ovulatórios congelados através
de método lento (-3º C por minuto) ou congelamento
rápido (-1000º C por minuto) quando descongelados
a 0º C não mostraram problemas na fertilização
quando comparados com o grupo controle. Tal fato, sugere
que o choque do congelamento não é um importante
fator no processo de criopreservação. Imoedemhe
e Sigue (1992) usando como crioprotetores PROH e sucrose
e um método de congelamento lento, observaram que
os oócitos criopreservados com "cumulus"
possuiam maior sobrevidade (54%) do que aqueles sem essa
camada celular (27%), sendo os níveis de fertilização
de 44% versus 25%, respectivamente para com e sem cumulus.
Criopreservação do sêmen
Congelamento vertical
O congelamento do sêmen é uma técnica
antiga sendo um dos maiores avanços nessa área
a descoberta das propriedades crioprotetoras do glicerol.
Ao passar dos anos, várias modificações
foram descritas com a finalidade de aumentar a taxa de recuperação
do esperma criopreservado. Em 1963, introduziu-se o nitrogênio
líquido para o processo de estocagem. Atualmente,
tornou-se obrigatório o emprego de sêmen congelado
(uso após 6 meses de congelamento desde que o doador
apresente novo teste negativo para SIDA) nos programas de
inseminação com esperma de doador, pela possibilidade
da existência no esperma do vírus da síndrome
de imunodeficência adquirida (SIDA). O congelamento
do sêmen necessita do preparo de 3 soluções
crioprotetoras com variações na concentração
dos seus componentes químicos (Lucena, 1990). As
principais substâncias que participam na sua constituição
são as seguintes : gema do ovo 50% e nutrientes.
Preparo da solução de gema de ovo
A gema do ovo possui efeito protetor sobre a motilidade
dos espermatozóides. No preparo da solução
de gema de ovo usam-se 6 ovos frescos, dos quais separa-se
a gema da clara. Em seguida, coloca-se a gema sobre o papel
de filtro para reter a membrana perivitelínica que
é tóxica, para isto pressiona-se a gema entre
o papel de filtro para extrair seu conteúdo e deposita-se
o recuperado numa proveta estéril de 100 ml. O volume
ocupado pelas gemas é anotado e adiciona-se uma quantidade
igual de água destilada a fim de se obter uma solução
a 50%. A proveta é fechada com papel alumínio
e homogeinizada delicadamente. A solução final
é repartida em vários tubos cônicos
graduados e estéreis que são centrifugados
em 3500 rotações por minuto durante 30 minutos,
após o que retira-se o sobrenadante e repete-se a
centrifugação por 15 minutos (para conservar
as lipoproteínas de baixo peso molecular cuja ação
protetora é estabilizar a membrana do espermatozóide).
Os sobrenadantes obtidos em todos os tubos são colocados
em Erlenmeyer estéril de 150 ml. A solução
de gema de ovo (50%) pode ser conservada durante 24 horas
na temperatura de 4º C, antes de terminar a preparação
do meio crioprotetor.
Preparo dos nutrientes
Os nutrientes usados (citrato de sódio, frutose,
bicarbonato de sódio) são pesados em balança
de precisão. Dissolver os componentes nas concentrações
indicadas (Tabela 9.1) em água destilada 3 ml e adicionar
a esta mistura glicerol (previamente medido em proveta de
100 ml). Adiciona-se a quantidade necessária de gema
de ovo (depende da concentração de espermatozóides
na amostra) e complementa-se para 100 ml com água
destilada.
Pasteurização do crioprotetor
Para a pasteurização do crioprotetor, aquecer
um volume de água em vasilha. Introduzir um termômetro
limpo e desinfetado com álcool dentro do Erlenmeyer
que contém a solução crioprotetora,
transferir esta para a vasilha com água aquecida,
agitar suavemente e quando a temperatura atingir 68º
C retirar o meio, pois valores superiores podem endurecer
a gema. A conservação do meio crioprotetor
é realizada após a solução crioprotetora
esfriar, adiciona-se penicilina G sódica (50 mg/l).
Divide-se o material em tubos de 10 ml para seu armazenamento
no "freezer" a 18º C. O período máximo
de congelamento será de 3 meses, sendo permitido
descongelar e recongelar sem nenhum problema.
Análise da qualidade da solução crioprotetora
Para o controle de qualidade da solução crioprotetora
coloca-se 50 ul desta em contacto com 100ul de sêmen
liquefeito e analisa-se uma gota deste preparado no microscópio,
deve-se obter uma motilidade de no mínimo 70%, em
relação ao controle inicial. Em princípio,
não devem ser observados espermatozóides com
flagelos enrolados (muito sal) ou flagelos rígicos
(pouco sal).
Cuidados especiais e resultados clínicos
Em seguida, a amostra de sêmen liquefeita na temperatura
de 37º C é misturada com a solução
crioprotetora adequada para a concentração
inicial obtida : Solução I : > 200 milhões
de espermatozóides por ml, proporção:
1 volume de sêmen para 1 volume de solução
crioprotetora. Solução II : 100 a 200 milhões
de espermatozóides por ml, proporção:
2 volumes de sêmen para 1 volume de solução
crioprotetora. Solução III : de 20 a 100 milhões
de espermatozóides por ml, proporção
3 volumes de sêmen para 1 volume da solução
crioprotetora. Rotineiramente, as "paillettes"
de 0.5 ml são identificadas com o nome do paciente
e a data do congelamento. O sêmen mais a solução
crioprotetora são aspirados com uma seringa de 1
ml até tocar no tampão de algodão da
"paillete". Imediatamente, selar a extremidade
oposta com pó selante (deixar um espaço de
0.5 cm a 1.0 cm antes do ponto do selante). Para o congelamento
do sêmen, as "paillettes" preenchidas são
colocadas verticalmente num suporte com capacidade para
42 "paillettes". A fim de que o congelamento seja
idêntico nas diferentes "paillettes", o
suporte deve estar totalmente preenchido, quando isto não
for possível, completar o suporte com "paillettes"
maciças de tamanho e massa igual as preenchidas com
sêmen. O suporte com as "paillettes" é
colocado dentro de um recipiente metálico menor (nº
1) que por sua vez é adaptado dentro de outro recipiente
metálico de maior tamanho (nº 2), estes materiais
são colocados dentro de uma caixa de isopor (Figura
9.5). O nível de nitrogênio líquido
dentro dos recipientes metálicos (intercomunicados
por orifícios) deve entrar em contacto com a base
do suporte acrílico das "paillettes", no
entanto, o nitrogênio líquido não deve
tocar as "paillettes". A velocidade do congelamento
é idêntica em todas as "paillettes"
sendo neste momento de cerca de 200º C por minuto.
A cristalização ocorre de maneira espontânea
depois da temperatura de -18º C. Esta cristalização
demora de 10 a 15 segundos, logo a velocidade de congelamento
(praticamente linear) vai de 170º C por minuto até
-80º C. Nesta temperatura a curva de esfriamento toma
uma forma assintótica até -150º C, e
a duração total do esfriamento é de
aproximadamente 2 minutos. Em seguida, as "paillettes
são submersas em nitrogênio líquido
previamente colocado em isopor e transferidas para aqui
identificada, armazenadas em canecas no botijão com
nitrogênio líquido. O descongelamento do sêmen
é realizado na temperatura ambiente em aproximadamente
2 minutos. Deve-se lembrar que as bactérias aeróbicas
consideradas comensais estão presentes na maior parte
dos ejaculados a fresco e recuperam-se depois da criopreservação
em nitrogênio líquido. Finalmente, realiza-se
o controle do processo de congelamento-descongelamento,
examinando-se a motilidade e a vitalidade dos espermatozóides.
Em 1994, Baruffi e cols. descreveram os resultados do programa
de criopreservação do Centro de Reprodução
Humana da Maternidade Sinhá Junqueira. A taxa média
de sobrevida dos espermatozóides após o descongelamento
foi de 77.4 ± 11%. O número médio de
espermatozóides móveis inseminados variou
de 1.35 milhões a 18.45 milhões por aplicação.
A taxa de gravidez por ciclo foi de 27.7%. A técnica
de criopreservação utilizada mostrou-se eficaz,
de manuseio simples e de custo operacional baixo.
Composição de três soluções
para criopreservação de sêmen
Tabela 9.1 - Composição de três soluções
para criopreservação de sêmen
Soluções I II III
Sêmen/meio 1/1 2/1 3/1
Gema de ovo 50% 36 ml 54 ml 62 ml
Citrato de sódio 0.66 g 1.00 g 1.32 g
Frutose 1% 2.0 g 3.0 g 4.0 g
Glicerol 7% 14 ml 21 ml 28 ml
Bicarbonato sódio 0.10 g 0.15 g 0.20 g
Penicilina 0.06 g 0.06 g 0.06 g
Água destilada q.s.p. 100 ml para todos os tubos
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