Capacitação
Espermática
As
técnicas de reprodução assistida agem
no tratamento da infertilidade conjugal pelo manuseio e
transferência de gametas e embriões para o
trato genital da mulher. Assim sendo, a coleta, o preparo
e a obtenção desses "agentes terapêuticos"
merecem cuidados especiais. A coleta do sêmen é
realizada através de masturbação, após
um período de abstinência sexual de 3 a 5 dias.
Esta é a forma corrente de obtenção
do esperma, entretanto, quando não há condições
para esse procedimento, outros métodos são
empregados (estimulação elétrica ou
vibratória direta sobre a próstata ou pênis,
punção das vias espermáticas, biópsia
do testículo, coleta e isolamento de espermatozóides
na urina). Por outro lado, os espermatozóides de
mamíferos necessitam sofrer modificações
funcionais e estruturais para fertilizarem os oócitos.
Habitualmente, o conjunto destas transformações
é definido como capacitação espermática
(Austin, 1952). Originalmente, acreditava-se que estas mudanças
ocorreriam apenas quando os espermatozóides estivessem
em contacto com o trato genital feminino. Do ponto de vista
fisiológico, essas alterações deveriam
ser progressivas desde que os espermatozóides gastam
um tempo para atingirem as trompas e iniciarem sua interação
com os oócitos. Precocemente, adquirir a capacidade
de fertilizar poderia ser um problema (Bedford e Chang,
1983). Todavia, subseqüentes estudos mostraram que
se pode obter capacitação "in vitro"
dos espermatozóides na presença de fluidos
biológicos ou simples meios de cultura (Chang, 1951).
Em geral, os espermatozóides capacitados são
aqueles que apresentam reação acrossômica.
Inicialmente, essas modificações ocorrem ao
nível molecular da membrana plasmática e resultam
em alterações morfológicas (reação
acrossômica) e fisiológicas (hiperativação
do flagelo). A reação acrossômica é
caracterizada pela fusão entre a membrana plasmática
e a acrossomal externa, resultando em formação
de vesículas e permitindo a liberação
de enzimas do conteúdo acrossômico (Figura
4.1). Os espermatozóides necessitam reagir com componentes
dos oócitos (células do "cumulus",
fluido folicular, zona pelúcida) para completarem
a reação acrossômica. O processo de
capacitação depende de alterações
da permeabilidade da membrana ligadas ao transporte dos
íons Ca++. A modulação do íon
cálcio é fundamental para os espermatozóides
adquirirem a capacidade de fertilização tendo
esse processo 3 aspectos fundamentais :1 - a presença
de uma TPA se capaz de bombar o Ca++ para fora da célula.
2 - o processo de troca de Ca++ (exterior) com Na+ para
o interior. 3 - canais de cálcio que facilitariam
a rapidez de fluxo (Fraser, 1994). Por outro lado, existem
várias evidências que sugerem a necessidade
da presença de Ca++ no meio extracelular. Fraser
(1982) tratou os espermatozóides com Ca++ ionóforo
A23187 na presença de Ca++ extracelular, observando
uma rápida passagem de Ca++ para dentro da célula,
tal fato é acompanhado de exocitose da região
acrossômica. Por outro lado, com o sucesso da injeção
intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)
ficou estabelecido que a reação acrossômica
não é pré-requisito para o núcleo
do espermatozóide participar no processo meiótico
(Liu e cols., 1995). A hiperativação caracteriza-se
por mudanças no padrão do batimento flagelar,
fato que facilitaria a penetração dos espermatozóides
através dos diversos envoltórios dos oócitos.
Além das diversas técnicas de preparo do esperma,
fatores biológicos e farmacológicos poderiam
ser usados para melhorar a qualidade do esperma em laboratório.
Freqüentemente, o soro humano é empregado para
enriquecer o meio de cultura após inativação
na temperatura de 56º C por 45 minutos. Acredita-se
que este procedimento aumentaria a sobrevida dos espermatozóides,
assim como a taxa de fecundação e gravidez
nos casos de oligoastenozoospermia (Makler e cols., 1980).
Diversos trabalhos, porém, relataram que o fluido
folicular age sobre os espermatozóides de modo significativo,
elevando sua motilidade, o poder de penetração
nos oócitos de hamster e a taxa de fertilização
dos oócitos humanos em cultura "in vitro"
(Delgado e cols., 1987; Mortimer e Camenzind, 1989; Ghetler
e cols., 1990; Chao e cols., 1991). Da mesma maneira, a
adição de fluido folicular humano melhoraria
a motilidade dos espermatozóides e a taxa de gravidez
após inseminações intra-uterinas (Blumenfeld
e Nahhas, 1989; Mbizvo e cols., 1990). Na mesma linha de
pensamento, Franco Jr. e cols. (1994) não observaram
diferenças significativas entre a taxa de formação
embrionária (total de embriões obtidos / total
de oócitos inseminados) quando os espermatozóides
foram capacitados com (tempo de incubação
curta ou lenta) ou sem fluido folicular. Diferentemente,
Revelli e cols. (1995) observaram que o fluido folicular
e uma mistura de fluido folicular e peritoneal (mas não
o fluido peritoneal isolado) podem induzir uma rápida
reação acrossômica. Os derivados da
metilxantina (cafeína, teofilina, pentoxifilina)
possuem a propriedade de estimular a motilidade progressiva
espermática pois inibem a adenosina cíclica
3'-5' monofosfato (AMP) fosfodiesterase levando a um aumento
intracelular das concentrações de cAMP (Bunge,
1973; Yovich e cols., 1988). Fuse e cols. (1993) observaram
que a pentoxifilina induziu "in vitro" um aumento
da motilidade espermática, com aumento da velocidade
e da amplitude do deslocamento lateral da cabeça
dos espermatozóides, fato observado até 120
minutos do início da incubação. Em
linhas gerais, os procedimentos laboratoriais de preparo
e capacitação dos espermatozóides podem
ser divididos nos seguintes métodos :A - Migração.
B - Sedimentação-migração ou
"swim-up". C - Separação por gradientes
de densidade.
Métodos de Migração
Migração ascendente
O método de migração ascendente ou
vertical é a mais simples técnica de preparação
espermática, também é chamado de camada.
O esperma liquefeito é depositado na parte inferior
de um tubo contendo um volume de meio de cultura (Menezo
B2, GPM, IVF-50, etc). Em seguida, incuba-se na temperatura
de 37º C por um período de 45 a 60 minutos,
permitindo, dessa forma, a migração dos espermatozóides
para o meio. Em seguida, 80% da parte superior do meio de
cultura é retirada e os espermatozóides obtidos
usados para as técnicas de reprodução
assistida. Rotineiramente, o meio de cultura é enriquecido
com soro inativado da paciente a 30% e um volume de 1.5
ml é colocado em tubo de Falcon. Em seguida, deposita-se
no fundo do tubo sob o meio, cerca de 1.0 ml de sêmen
liquefeito. Incuba-se por 45 minutos à 37º C
em atmosfera de CO2 a 5% (exceto para a técnica de
inseminação). Após esse período,
retira-se o sobrenadante que é centrifugado em 200
g por 5 minutos. Posteriormente, dilui-se o sedimento obtido
com 1 ml de meio e repete-se a centrifugação
nas condições citadas. Finalmente, o segundo
sedimento obtido é ressuspenso no volume desejado.
(Figura 4.2). Em caso de fertilização "in
vitro" (FIV), retirar o sobrenadante sob o segundo
sedimento e adicionar 0.5 ml de meio enriquecido com soro
inativado da paciente a 30%. Incubar durante 15 minutos
à 37º C. Retirar 0.4 ml do sobrenadante e transferir
para novo tubo de Falcon, após o que uma alíquota
de 10u l é depositada numa câmara de Makler
para avaliação da concentração
e motilidade dos espermatozóides.
Migração ascendente-sedimentação
Tea e cols. (1983) descreveram um método de migração
ascendente e sedimentação numa câmara
especial (Figura 4.3). Lucena e cols. (1989) empregando
este método para capacitação dos espermatozóides
em procedimentos de FIV conseguiram fecundação
oocitária em 85% dos pacientes com normozoospermia.
As amostras não apresentaram espermatozóides
imóveis, morfologicamente anormais, imaturos, demais
células ou debris. O método de capacitação
espermática através da migração
scendente-sedimentação requer a utilização
de câmara de Tea-Jondet-Scholler. Dessa forma, um
volume de 1.5ml de meio de cultura enriquecido com 30% de
soro inativado da paciente é depositado na parte
interna e externa da câmara. Em seguida, 0.2ml do
sêmen liquefeito é depositado nas laterais
de fora da câmara e após um período
de incubação de 2 horas `a 37º C, retira-se
0.3ml do fundo do cone central da câmara. Em seguida,
a concentração e motilidade dos espermatozóides
é analisada, acertando-se a concentração
conforme a técnica de reprodução assistida
indicada.
Métodos de sedimentação-migração
ou "swim-up"
O método tradicional de sedimentação-migração
é chamado de "swim-up". Recentemente, certas
críticas foram levantadas sobre a técnica
de "swim-up", pela detecção da presença
de radicais superóxidos nos sedimentos formados após
as centrifugações (Aitken e Clarkson, 1988).
Tal fato, ocorrendo antes do processo de migração,
acarretaria lesões irreversíveis das membranas
plasmáticas dos espermatozóides, basicamente
compostas por fosfolípides e sensíveis à
ação destes radicais oxidantes, prejudicando
o futuro processo de capacitação. A técnica
de "swim-up" é usada nos programas de reprodução
assistida, especialmente quando o espermograma prévio
foi considerado normal. Nessa situação, geralmente
há uma alta proporção de espermatozóides
móveis, morfologicamente normais, ausência
de massas citoplasmáticas anucleadas e debris, sendo
os níveis de fertilização excelentes,
especialmente em FIV convencional. Os problemas de fertilização
com o "swim-up" surgiram quando se trabalhou com
amostras de sêmen ricas em espermatozóides
anormais, mortos, debris, restos celulares, neutrófilos,
macrófagos, etc. Na sedimentação-migração,
o esperma liquefeito é distribuido em vários
tubos e lavado com meio de cultura suplementado com soro
inativado da paciente a 30%, na proporção
de 2 ml de meio para 1 ml de sêmen. Em seguida, executa-se
duas centrifugações consecutivas em 200 g
por 5 minutos, sempre com subseqüente eliminação
do sobrenadante. Após o que, um volume de meio de
cultura é cuidadosamente depositado sobre o sedimento
resultante da última centrifugação,
sendo incubado pelo tempo de 45 a 60 minutos `a 37º
C em atmosfera de C02 a 5% (exceto para a técnica
de inseminação), para permitir a migração
dos espermatozóides. Após esse período,
retirar o sobrenadante, analisar a concentração
e motilidade dos espermatozóides recuperados e acertar
a concentração dos espermatozóides
conforme a técnica de reprodução assistida
indicada (Figura 4.4).
Métodos de separação por gradientes
de densidade
Atualmente, o método de gradientes de Percoll é
um dos mais utilizados, aumentando a recuperação
e porcentagem de espermatozóides móveis, especialmente
nos casos de oligoastenozoospermia. Em 1981, Gorus e Pipeleers
empregaram o Percoll pela primeira vez na separação
espermática. Esse método consiste de uma filtração
dos espermatozóides através de gradientes
com diferentes densidades de Percoll, de forma que nas camadas
de densidades inferiores são retidos os espermatozóides
imóveis e componentes celulares do plasma seminal,
nas camadas de densidade superiores permanecem os espermatozóides
móveis. Geralmente, o gradiente descontínuo
de Percoll é preparado através de uma sequência
de pipetagens das frações 100%, 90%, 70%,
60% e 40%, sendo o esperma liquefeito depositado no topo
da coluna que é centrifugada por cerca de 20 a 30
minutos de 300 g a 600 g . As frações 40%,
60%, 70% contém o plasma seminal, espermatozóides
imóveis e outras células, enquanto que as
demais frações, onde se encontram os espermatozóides
móveis são diluídas com meio de cultura
e centrifugadas para eliminar o Percoll. Diversos pesquisadores
simplificam ao máximo este método propondo
o uso de gradientes com um menor número de frações
de Percoll (Tredway e cols., 1990; Van der Zwalmen e cols.,
1991). Por outro lado, Ord e cols. (1990) indicaram uma
redução no número (50%, 70%, 95%) e
volume (0.3ml) das frações de Percoll (Mini-Percoll)
em casos de oligoastenozoospermia (menos que 5 x 106 espermatozóides
móveis por ml) e relataram uma fertilização
em 40% dos oócitos inseminados "in vitro"
contra apenas 7% no grupo controle (swim-up). No Centro
de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá
Junqueira usa-se o método dos gradientes de Percoll
da seguinte forma : 1 - Prepara-se uma solução
isotônica de Percoll (SI) com 9 ml de Percoll mais
1 ml de Ham F-10 (10 x concentrado). Ajusta-se a osmolaridade
para 280 mOsm/Kg H20. Em seguida, adiciona-se penicilina
na dose de 60 mg/l. Filtra-se a solução em
0.22 m sendo estocada até 30 dias `a 4 C. 2 - O preparo
dos gradientes de Percoll é realizado com as seguintes
diluições (Figura 4.5) : A. Solução
90% : 1.35 ml de SI + 0.15 ml de meio de cultura com 30%
de soro inativado (MC-30). B. Solução 40%
: 0.6 ml de SI + 0.9 ml de MC-30. Assim sendo, coloca-se
1.5 ml dos diferentes gradientes em tubo cônico de
15 ml (Corning). Acima do gradientes de 40%, deposita-se
um volume até 3 ml de sêmen liquefeito. Centrifuga-se
em 200 g por 20 minutos, no caso de amostras viscosas aumenta-se
o tempo de centrifugação. Após a centrifugação
remove-se o plasma seminal e a camada do gradiente de 40%.
Finalmente, lava-se o sedimento formado no fundo do tubo
e a camada correspondente ao gradiente de 90% com 10 ml
de MC-30, uma vez em 200 g por 10 minutos. O sedimento é
ressuspenso no volume desejado com MC-30. Nesse ponto, na
execução da técnica de FIV, realiza-se
um "swim-up" no último sedimento com adição
de 0.5 ml de MC-30, e incubação por 15 minutos
em atmosfera de CO2 a 5% na temperatura de 37º C. Em
seguida, acerta-se a concentração de espermatozóides
para a inseminação dos oócitos. Por
outro lado, uma solução de Nycodenz também
pode ser utilizada para preparar gradientes, selecionar
e recuperar espermatozóides móveis (Gellert-Mortimer
e cols., 1988). Mauri e cols. (1993) analisaram um total
de 17 ciclos de FIV com o objetivo de comparar os índices
de clivagem embrionária após a inseminação
de oócitos com espermatozóides capacitados
pela técnica modificada de sedimentação-migração
(grupo A) e pelos gradientes de densidade do Nycodenz (grupo
B). Todas as amostras de sêmen eram normais quanto
a concentração e motilidade dos espermatozóides.
Os resultados não mostraram diferença entre
os índices de clivagem nos embriões do grupo
A versus os do grupo B. Assim sendo, não houve vantagem
no emprego dos gradientes de densidade de Nycodenz na capacitação
dos espermatozóides em relação `a técnica
clássica modificada de sedimentação-migração.
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